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第一部分Calsyntenin在癫痫大鼠脑中差异表达研究目的:本实验以氯化锂-匹鲁卡品点燃的慢性癫痫大鼠为实验模型。通过免疫印迹(Western blot)方法检测有关指标(calsyntenin1、calsyntenin2、calsyntenin3)在癫痫组大鼠和对照组大鼠的脑组织中是否有表达水平差异,筛选出两组间表达差异最大的蛋白作为本实验的主要研究目标。方法:1.用氯化锂-匹鲁卡品将35只健康雄性成年SD大鼠点燃,把具有自发性发作的大鼠作为癫痫组,模拟人类颞叶癫痫,而没有自发性发作的大鼠作为对照组。2.采用免疫印迹(Western blot)技术检测钙结合蛋白1(calsyntenin1、Cst1)、钙结合蛋白2(calsyntenin2、Cst2)、钙结合蛋白3(calsyntenin3、Cst3)在癫痫组和对照组大鼠脑组织的表达水平变化。结果:与对照组相比,Cst1在癫痫组大鼠脑组织(海马和皮质)中表达水平较高,且差异具有显著性(P﹤0.05)。Cst3蛋白在两组间的表达水平差别不大,差异没有统计学意义(P﹥0.05)。始终未检测到Cst2的蛋白条带。结论:通过预实验筛选发现Cst1在癫痫组和对照组间表达有明显差异,且差异具有统计学意义(P﹤0.05),提示Cst1可能和癫痫有关,因此本实验最终选定Cst1作为研究目标。第二部分Cst1在慢性癫痫大鼠中的表达规律目的:进一步探讨Cst1在大鼠脑组织中的表达方法:1.用氯化锂-匹鲁卡品将35只健康雄性成年SD大鼠点燃,把具有自发性发作的大鼠作为癫痫组,而没有自发性发作的大鼠作为对照组(同第一部分)。2.运用免疫组织化学和免疫组织荧光的方法对Cst1进行定位、半定量分析。结果:1.免疫组化结果显示,Cst1广泛表达在大鼠的大脑皮质和海马的CA1、CA2、CA3和DG区域,且主要表达在细胞浆中。半定量的分析提示癫痫组的Cst1蛋白表达量明显高于对照组,且差异有显著性(P﹤0.05)。2.免疫组织荧光结果提示Cst1和神经元共表达,且主要表达在神经元的胞浆中,而不表达在细胞核;Cst1不与星形胶质细胞共表达。结论:定位分析发现Cst1在癫痫大鼠皮质和海马广泛分布,主要表达在神经元的细胞浆中。与对照组相比,癫痫组大鼠脑组织的Cst1表达量明显较高,与第一部分的结果一致,提示其可能与癫痫相关。第三部分Cst1在癫痫形成过程中的功能研究目的:进一步明确Cst1与癫痫的相关性,并探索其在癫痫发生过程中的作用。方法:1.此阶段实验选取55只成年雄性SD大鼠,采用氯化锂-匹鲁卡品诱导癫痫持续状态(status epilepticus,SE)并对其发作进行分级,共48只大鼠的发作等级在4级及以上。将这48只大鼠随机平分为3组:SE组(n=16)、SE+LV-GFP组(n=16)和SE+LV-Cst1-RNAi组(n=16)。在SE后第2天分别给SE+LV-GFP组和SE+LV-Cst1-RNAi组注射空病毒和Cst1干扰病毒,SE组不给予干预处理。在SE后第7天采用Western blot技术检测各组大鼠海马的Cst1的表达量变化。2.在诱导SE后的连续8周时间,每天观察各组大鼠的行为学变化,主要观察指标是大鼠自发性发作的潜伏期(从SE到第1次自发性发作的时间)、发作次数及各组的点燃率。结果:1.Western blot结果表明在SE后第7天,SE+LV-Cst1-RNAi组的Cst1的表达水平较其他三组明显降低,且差异具有统计学意义(P﹤0.05),而其他三组间无统计学差异。2.各组大鼠潜伏期分别为:SE组(11.80±2.17天)、SE+GFP组(12.40±1.67天),统计分析两组间自发发作的潜伏期无明显差异;和前两组相比较,SE+Cst1+RNAi组大鼠的潜伏期(15.14±2.41天)有所延长,且差异具有显著性(P﹤0.05)。4.各组大鼠自发发作次数:统计分析各组大鼠慢性期2周内自发性发作结果显示:SE组(4.60±1.67次)、SE+GFP组(4.80±2.05次)、SE+Cst1+RNAi组(2.0±0.89次)。SE+Cst1+RNAi组的发作次数较其他两组明显减少,且差异具有显著性(P﹤0.05);而其他两组间没有明显差异。结论:用干预剂Cst1-RNAi降低大鼠海马Cst1蛋白的表达量后,观察行为学发现,SE+Cst1+RNAi组大鼠的慢性自发性痫性发作的潜伏期延长,自发性发作次数减少,但各组点燃率并无明显变化,因此我们认为Cst1可能促进癫痫发作。