miR-24对绒毛膜癌JEG-3细胞株的凋亡作用研究

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绒毛膜癌(choriocarcinoma CC)简称绒癌,是一种继发于正常或异常妊娠之后的滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic tumor,GTT)。绒癌分为妊娠性绒癌(gestational choriocarcinoma, GC)和非妊娠性绒癌(non-gestational choriocarcinoma,NGC)两种。在我国及东南亚国家发病率较高,其中50%发生于葡萄胎之后,25%发生于流产后,22.5%发生于足月妊娠之后,2.5%发生于异位妊娠之后。绒癌多数发生于生育期年龄,也有少数发生于绝经后。其恶性程度极高,化疗药物问世前,其死亡率90%以上。目前治疗以化疗或辅以手术治疗为主。正常滋养细胞有较强地分裂增殖能力,滋养细胞发生的肿瘤也具有较强的增殖分裂能力。近年来部分患者在化疗过程中出现耐药,使耐药难治性绒癌预后较差。microRNA(miRNA)是真核生物中一类长度约为22个核苷酸的参与基因转录后水平调控的非编码小分子单链RNA,能通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控。在生物的生长发育,细胞增殖、分化和凋亡等诸多生命活动过程中发挥重要作用。近年来,miRNA与肿瘤相关性的研究已成为研究热点。 miR-24广泛存在于哺乳动物多种组织,其序列为5-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG3',最先由Lagos-Quintanazai[1]于2001年在非脊椎和脊椎动物研究中发现。有研究表明人类miR-24表达为miR-24-1和miR-24-2两种,分别定位于第9号和第19号染色体上。在人类基因组中,miR-24-1与其相邻的miR-23b、miR-27b形成一个基因簇,miR-24-2和miR-27a、miR-23a组成另外一个基因簇。而miR-24-1和miR-24-2在小鼠基因组中分别定位于第8号和第13号染色体上[2]。miRNA功能主要表现调节细胞生长与凋亡。有研究表明miR-24在宫颈癌Hela细胞中具有抑制细胞生长、促进凋亡的作用[3]。转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一组新近发现的具有广泛生物活性的细胞因子超家族。哺乳动物中发现至少有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和TGF-β1β2四个亚型,在人体内主要由TGF-β1发挥作用,其信号由Smads家族介导。TGF-β信号通过Smads蛋白从细胞表面传递入细胞核。Smads蛋白家族依据作用不同分为三类:(1)受体调节型Smad(Receptor-regulated Smads,R-Smad),包括Smad1、5、8介导骨形成蛋白信号通路和Smad2与Smad3转换TGF-βs和活化素信号;(2)共同介质型Smad(Common mediator Smad,Co-Smad),以Smad4为代表,与R-Smad形成复合体一起,传递TGF-β或活化素骨形成蛋白信号通路信号进入细胞核调节靶基因的转录。(3)抑制型Smad(InhibitorySmad,I-Smad),负性调节TGF-β信号通路。Sun等[2]研究发现TGF-β1通过Smad结合位点抑制miR-24的转录。本文旨在探讨miR-24对绒癌JEG-3细胞株的凋亡机制的研究。目的:检测绒毛膜癌细胞JEG-3中miR-24表达以及TGF-β1对miR-24的抑制作用,进一步探讨miR-24在绒癌细胞中发挥的增殖或凋亡作用。方法:用15%(体积分数)胎牛血清的1640培养基,在37℃、5%(体积分数)CO2中培养绒毛膜癌JEG-3细胞。取对数生长期细胞分为两组其中一组加入TGF-β1处理,其终浓度为100ng/ml,一组不予处理,每组又以不同时间点24h、48h分为两个亚组。收集每组细胞,按Redzol一步法总RNA提取试剂盒提取总RNA,逆转录合成cDNA,实时定量PCR测定每组细胞中的miR-24表达量,实验重复3次。MTT比色法测定绒毛膜癌JEG-3细胞增殖活力,实验设4个平行复孔。流式细胞仪检测绒毛膜癌JEG-3细胞凋亡率,实验重复3次。结果:绒毛膜癌JEG-3细胞用含有15%(体积分数)胎牛血清的1640培养基,在37℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养。其生长状态良好,细胞膜完整,细胞核界限清晰,椭圆形或圆形,染色质均匀。用终浓度为100ng/ml的TGF-β1处理对数生长期绒毛膜癌JEG-3细胞,分别作用24h、48h后提取RNA,实时定量PCR法测定miRNA-24表达量实验组较对照组明显降低(P <0.05);用终浓度为100ng/ml的TGF-β1处理对数生长期绒毛膜癌JEG-3细胞,分别作用24h、48h后应用MTT法检测细胞增殖率明显升高(P <0.05);用终浓度为100ng/ml的TGF-β1处理对数生长期绒毛膜癌JEG-3细胞,分别作用24h、48h后采用流式细胞仪检测细胞凋亡率无明显变化(P>0.05)。结论:1. miRNA-24在绒毛膜癌JEG-3细胞中有表达。2. TGF-β1可抑制绒毛膜癌JEG-3细胞中miRNA-24的表达。3.miRNA-24下调可促进绒毛膜癌JEG-3细胞增殖。4.miRNA-24下调与绒毛膜癌JEG-3细胞凋亡无相关性。
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