苍耳子(Fructus Xanthii),为菊科植物苍耳Xanthium sibirium Patr.的干燥成熟带总苞的果实,收载于历版中国药典,在我国资源丰富,为历代治疗鼻病及头痛的要药。然而,古代文献记载和现代临床应用都发现苍耳对人体具有一定的毒性作用,毒性一直制约着其临床应用。关于苍耳子毒性的隐患始终未能排除,毒性成分及其作用机理未能阐明。因此,本课题首先采用小鼠急性毒性实验来明确苍耳子毒性损伤的靶器官主要为肝脏,采用体外肝细胞实验筛选毒性成分,并对目标成分进行整体动物毒性评价,在此基础上利用代谢组学技术,探讨了苍耳子的毒理学作用机制,为苍耳子的合理应用提供科学依据。本课题主要涵盖以下几方面内容:1.苍耳子毒性物质基础研究通过小鼠急性毒性跟踪筛选,以半数致死量LD50为指标,确定了苍耳子的毒性部位为水提取物经AB-8大孔树脂柱层析的水洗脱部位(D1),并对此部位的化学成分进行了系统的研究,从中分离出7个化合物,分别为贝壳杉烯苷类、酚酸类和含硫杂原子类化合物。2.苍耳子毒性部位的毒性评价采用小鼠急性毒性实验,通过病理组织学观察明确苍耳子毒性损伤的靶器官主要为肝脏,小鼠血清生化指标和肝组织匀浆生化指标检测结果表明,小鼠发生了严重的脂质过氧化损伤。本实验结果提示苍耳子的中毒原因可能是自由基攻击细胞膜中的不饱和脂肪酸,发生了脂质过氧化反应,从而导致肝细胞膜通透性的改变。在此基础上评价了苍耳子的慢性肝毒性,结果表明在长期连续重复多次给药的情况下,小鼠出现了较为严重的肝毒性反应,动物的小叶周围脂肪变性及溶解性坏死,有较多量的淋巴、浆细胞等炎细胞浸润,并伴有较明显的纤维组织增生。由于慢性鼻炎、鼻窦炎等疾病需长期用药,剂量使用不当可引起慢性蓄积中毒,导致肝功能损害。所以长期、大剂量服用苍耳子对机体的不良影响应引起足够的重视。3.毒性成分的筛选和毒性评价采用人正常肝细胞株L-02和正常大鼠肝细胞株BRL作为体外细胞毒性的试验模型,比较研究苍耳子主要成分的细胞毒性。结果表明苍术苷、羧基苍术苷和4’-去磺基苍术苷随着浓度逐渐升高,抑制作用逐渐增强,浓度为10-4 mol/L时能够明显抑制对两种细胞的增殖作用。苍术苷等造成了不同程度的细胞皱缩现象,细胞间隙扩大,随着给药浓度增加,细胞出现空泡化,死细胞明显增多。苍术苷等引起LDH漏出增加,细胞通透性增加,具有一定的细胞毒作用。并采用整体动物实验对目标成分苍术苷进行了毒性评价,结果表明苍术苷高剂量组对小鼠的肝脏造成了较严重的损伤,且中毒机理可能与苍耳子毒性部位相似,证明了苍耳子中的主要毒性成分为贝壳杉烯苷类化合物,与体外实验结果相符。4.利用代谢组学技术探讨苍耳子的毒性作用机制利用1H NMR技术研究苍耳子处理后大鼠尿液和血浆中内源性代谢产物谱的变化,研究发现尿液中乳酸盐、葡萄糖、马尿酸盐、醋酸盐、三甲胺N氧化物、色氨酸、二甲胺、肌醇、柠檬酸盐、N甲基烟酸盐和酪氨酸明显升高,而酮戊二酸、肌酐、异戊酸盐、琥珀酸盐、组氨酸、丁酸盐、二甲基甘氨酸、N-乙酰基-半胱氨酸、牛磺酸和赖氨酸含量下降。血浆中异戊酸盐、乳酸盐、缬氨酸、谷氨酸盐、高密度脂蛋白、乙酸盐、肌酐、丙酮和尿素升高,而甘氨胆碱和葡萄糖明显下降。柠檬酸盐是三羧酸循环的中间产物,主要在肝细胞线粒体中进行代谢;琥珀酸盐的含量的降低是由于降低脂肪酸分解代谢。这些成分的变化影响肝细胞线粒体的能量代谢;烟酸盐及甲基烟酰胺均为色氨酸NAD+通路的产物,色氨酸代谢产物的升高伴随肝脏中脂质过氧化酶的生成减少,影响局部氧化还原平衡。肌醇,乳酸的浓度升高,是体内缺氧代谢的结果。所以苍耳子的毒性主要与其影响了肝细胞能量代谢有关。尿液中的柠檬酸盐、马尿酸盐、色氨酸等可以作为苍耳子的主要生物标志物研究。综上,苍耳子毒性作用靶器官主要是肝脏,贝壳杉烯苷类化合物是主要的毒性成分,其毒性作用与苍耳子引起动物肝脏的脂质过氧化损伤和影响肝细胞能量代谢机理有关。本课题将代谢组学与传统毒理学研究方法相结合,初步揭示了中药苍耳子毒性作用的肝损伤机制。我们的研究显示,用代谢组学方法揭示的生物化学变化很容易与传统手段的测定结果相联系,更容易发现药物作用的生物化学物质基础和作用机制,因此,药物毒性作用机制的代谢组学研究必将在成分复杂的中药体系中发挥更大的作用。苍耳子的临床应用十分广泛,正常情况下使用苍耳子是安全的,但长期、大剂量使用会出现毒性反应,因此在临床上长期用药不要超过3-9 g,肝损伤患者应用时需要调整剂量,长期应用时要注意监测其肝功能。其他含贝壳杉烯苷类中药可能也有类似的毒性毒理机制,因此,应该建立质量标准,控制毒性成份的含量,加强对此类中药的不良反应监测。随着代谢组学技术的发展,此项技术将会越来越多的用于其他中草药毒性毒理的研究,对于实现中药现代化具有重要的意义。