论文部分内容阅读
禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian Sarcoma Virus,RSV)引起禽类多种肿瘤性疾病的统称。禽白血病病毒属于反转录病毒科(Retroviridae),甲型反转录病毒属。禽白血病引起病禽的死亡、淘汰、造成多组织多种类型的肿瘤。近年来,禽白血病病毒致病机理研究一直是该病研究热点,国内外科学家围绕禽白血病病毒感染致病致瘤机理开展了大量的研究工作,获得了宝贵的科研进展。但到目前为止,禽白血病病毒感染致病致肿瘤的机理还了解不多,尤其病毒如何利用细胞内信号通路调控细胞炎症发生,细胞生物学变化,造成机体免疫抑制以及最终导致肿瘤的形成等研究领域知之甚少。最近研究发现HIV、EBV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及卡波济肉瘤相关疱疹等病毒的感染都能引起Wnt信号通路异常激活,最终导致癌症肿瘤的发生。家禽Wnt信号通路研究领域起步较晚,家禽组织中Wnt信号通路的部分组分已经发现并克隆。有报道表明,Wnt信号通路活化是家禽原始生殖细胞增殖所必需的。J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J)感染引起的家禽生长发育迟缓是由于Wnt信号通路的下调引起。而经典Wnt信号通路与J亚群禽白血病病毒复制的关系还不清楚。本研究通过real-time PCR、Western blot和双荧光素酶报告系统等技术方法,并使用信号通路的激活剂和抑制剂,从基因转录和蛋白表达两个层面上重点研究GSK/β-catenin经典Wnt信号通路与J亚群禽白血病病毒复制的相关性,初步揭示Wnt信号通路对禽白血病病毒复制的影响,为全面解释禽白血病病毒的致病机理提供新的科学依据。1.激活经典Wnt信号通路有利于J亚群禽白血病病毒的增殖为了研究Wnt信号通路与ALV-J感染致病的关系,首先确定Wnt信号通路敏感的细胞模型为CEF细胞,然后采用信号通路激活剂GSK3 inhibitor X激活Wnt信号通路,检测信号通路相关分子的表达情况,J亚群禽白血病病毒编码蛋白表达情况,以及相关细胞炎症因子和抗病毒基因的表达情况。结果表明GSK3 inhibitor X能抑制GSK-3β活性,激活Wnt信号通路下游基因β-catenin、LEF1、TCF4、Axin2表达显著升高。同时病毒编码蛋白表达水平显著上升,病毒增殖显著加快,而这种变化可以被信号通路抑制剂iCRT14所干扰。细胞炎症因子IL-1β,IL-6,干扰素刺激因子OASL,ISG12-2以及抗病毒因子viperin表达都有不同程度的下降。细胞周期实验结果发现,信号通路激活剂GSK3 inhibitor X处理细胞后,S期细胞比例明显增加。综合以上实验结果表明,激活CEF细胞中的经典Wnt信号通路有利于ALV-J复制与增殖,这可能与Wnt信号通路调节细胞周期有关。2.抑制经典Wnt信号通路阻碍ALV-J的复制为了研究抑制经典Wnt信号通路对病毒复制的影响,本研究使用信号通路特异性抑制剂iCRT14处理CEF细胞,观察其对ALV-J复制的影响。实验结果显示,在CEF中iCRT14能极显著抑制ALV-J复制,并且呈现剂量依赖性。当使用iCRT14处理细胞后,Wnt通路下游基因β-catenin、LEF1、TCF4、CyclinD1、C-myc、Axin的表达也显著降低。细胞炎症因子IL-1β,干扰素刺激因子OASL的表达显著下降,而IL-6表达却显著增加。同时,细胞生长周期相关基因CDK6、CCNE1、CDK2都随着iCRT14剂量的增加呈现下降的趋势,细胞生长速率变缓。此外,本研究还利用siRNA干扰β-catenin表达抑制信号通路活化,此时的病毒表达同样受到抑制。这些结果表明抑制经典Wnt信号通路显著抑制J亚群禽白血病病毒在CEF细胞中的复制,这一作用可能同样与Wnt信号通路调节细胞周期有关。3.Wnt信号通路抑制剂在不同类型细胞中对ALV-J复制的影响已报道的研究表明Wnt信号通路在不同的细胞中可能呈现不同的生物学反应,因此本研究还选择了鸡肝癌细胞系LMH和鸡胚肾细胞CEK,研究Wnt信号通路抑制剂iCRT14对J亚群禽白血病病毒复制的影响。研究结果显示,ALV-J能够感染LMH和CEK细胞,使用抑制剂iCRT14处理细胞后,显著降低信号通路中β-catenin和CyclinD1基因的表达,同时ALV-J的复制也受到抑制。这一结果与CEF细胞结果一致,进一步说明抑制经典Wnt信号通路阻碍了J亚群禽白血病病毒的复制,其中具体的机制还需日后的研究来阐明。