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肾细胞癌（简称肾癌,renal cell carcinoma,RCC）发病率高、预后差,是肾脏最常见的恶性肿瘤,传统免疫治疗、化疗和放疗效果均不佳。早期发现的肾癌可通过部分或根治性切除术改善患者预后,但由于其发病隐匿,早期诊断困难,且术后复发和远处转移发生率高,降低了RCC患者的生存预期。VEGF/PDGFR/mTOR途径的分子靶向治疗药物已取代免疫治疗广泛应用于晚期肾癌患者,但是由于药物递送障碍、全身用药副反应、耐药等原因严重影响其疗效,很少有患者得到完全缓解。因此,肾癌的治疗仍需发展靶向性更好的药物或给药系统,达到高反应率、低副作用和持久的缓解。纳米级脂质超声微泡（Nanobubbles,NBs）不仅可以用于肿瘤的诊断和治疗,也是安全有效的药物或基因递送载体。既往的研究表明靶向载药超声微泡联合超声靶向纳米微泡破坏（ultrasound targeted nanobubble destruction,UTND）可以递送药物/治疗基因到特定的肿瘤内部,增强抗肿瘤疗效,并且减轻药物的毒副反应。在前期研究中,我们构建了肾癌相关抗原G250单克隆抗体靶向的脂质纳米微泡,证实该靶向纳米微泡能与表达肾癌相关抗原G250的肾癌细胞靶向结合;并通过噬菌体展示技术,制备出了能与G250抗原特异性结合的纳米抗体。本研究拟将疏水性分子靶向药物替西罗莫司（Temsirolimus,TEM）溶解在微泡脂质外壳,再通过生物素-亲和素桥连法将G250纳米抗体连接到微泡表面制备成适合局部释放的靶向载药纳米级超声微泡,随后研究其靶向肾细胞癌的能力,并联合UTND实现对RCC的精准治疗。第一部分靶向载替西罗莫司脂质纳米微泡的制备及表征检测目的:将分子靶向药物替西罗莫司溶解在纳米微泡脂质外壳制备出载替西罗莫司脂质纳米微泡（TNBs）,再将G250纳米抗体(NbG250)连接到微泡表面,制备靶向载药纳米微泡（G250-TNBs）。方法:采用薄膜水化法,联合机械震荡和静电作用制备TNBs,通过生物素-链霉亲和素桥连法将G250纳米抗体连接于TNBs表面制备G250-TNBs,通过免疫荧光法验证NbG250与微泡相偶联。使用光学显微镜观察G250-TNBs分布,透射电子显微镜观察其形态特点,马尔文粒径电位分析仪测量平均粒度和Zeta电位;高效液相色谱法（HPLC）测定替西罗莫司的包封率（EE）、载药效率（LE）,透析袋法评估G250-TNBs在超声作用下药物释放效率。结果:制备的G250-TNBs在普通光学显微镜下呈分散点状,计数后浓度约为（4.50±1.18）×109/mL;透射电镜下观察呈大小均匀的球形,直径约400nm;马尔文粒径电位分析仪测得G250-TNBs平均粒径为（399.67±99.67）nm,平均Zeta电位为（-23.33±2.63）mV。免疫荧光证实G250纳米抗体均匀分布在载药纳米微泡表面。HPLC测得G250-TNBs的药物包封率为（87.73±5.44）%,载药效率为（7.99±0.49）%;在72小时内G250-TNBs所携载药物缓慢释放,而超声辐照后微泡内所携载药物可迅速释放。结论:成功制备了NbG250靶向的载替西罗莫司脂质纳米微泡,药物包封率高;载药纳米微泡在72小时内性状稳定,超声辐照可以快速释放所携载药物。第二部分G250-TNBs体外寻靶能力及联合超声辐照后对人肾癌786-O细胞的增殖抑制目的:观测G250-TNBs靶向人肾癌细胞786-O的能力及联合超声辐照抑制786-O细胞生长的情况。方法:通过花环形成实验和花环形成阻断实验观察G250-TNBs靶向结合人肾癌786-O细胞的能力,CCK-8法检测G250-TNBs联合UTND对786-O细胞增殖抑制作用,一步法TUNEL染色和流式细胞术检测G250-TNBs联合UTND诱导786-O细胞凋亡的效果。结果:体外细胞实验发现,G250-TNBs对人肾癌细胞系786-O细胞具有特异靶向性;游离TEM组对786-O细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用明显优于TNBs组和G250-TNBs组（P<0.05）;而联合UTND后,TNBs组和G250-TNBs组对细胞增殖抑制和诱导凋亡作用显著增强（P<0.05）;最重要的是,G250-TNBs+US组抑制786-O细胞增殖能力及诱导凋亡作用显著高于其它组（P<0.05）。结论:G250-TNBs可靶向于人肾癌细胞786-O,联合UTND能显著抑制786-O细胞生长。第三部分G250-TNBs体内寻靶能力及联合UTND抑制肾癌生长的体内实验研究目的:在荷瘤裸鼠体内进行实验研究,通过增强超声成像能力探讨G250-TNBs靶向786-O的能力;观察G250-TNBs联合超声靶向纳米微泡破坏诱导肾癌细胞凋亡,抑制肾癌生长的效果。方法:在荷瘤裸鼠体内分别随机注射相同浓度和体积的G250-TNBs或TNBs,通过小动物成像的超声成像系统收集连续的动态超声图像,通过专用软件分析所收集图像的峰值强度（dB值）和持续时间,绘制时间--强度曲线并计算曲线下面积。为评估G250-TNBs联合UTND对荷瘤小鼠的抗肿瘤治疗效果,将30只荷瘤小鼠随机分配为6组（n=5）:对照组,TEM组,TNBs组,G250-TNBs组,TNBs+US组,G250-TNBs+US组;治疗后测量肿瘤的重量和大小,用于计算肿瘤体积和肿瘤抑制率。用苏木精和伊红（H&E）染色观察所取肿瘤组织的组织病理学变化,TUNEL检测评估肿瘤细胞凋亡率;随机选择5个高倍视野,根据阳性染色的肿瘤细胞数除以细胞总数计算凋亡指数（AI）。结果:裸小鼠体内增强成像实验结果提示,G250-TNBs的增强成像效果与TNBs有显著差异（P<0.05）,说明G250-TNBs在小鼠移植肿瘤体内同样也具有靶向作用;在各治疗组中,TNBs联合UTND组和G250-TNBs联合UTND组治疗后与其他各组相比较肿瘤体积缩小最明显（P<0.05）;而G250-TNBs联合UTND组比TNBs联合UTND组相比肿瘤抑制率和凋亡指数更高（P<0.05）。结论:G250-TNBs在荷瘤小鼠体内同样具有靶向肾癌细胞的能力,G250-TNBs联合UTND能有效抑制肾癌移植瘤生长,表明G250-TNBs联合UTND可作为一种潜在的靶向治疗手段应用于RCC的治疗。