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研究背景聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥（poly methyl methacrylate bone cement,PBC）是目前临床最为常见的骨填充材料,也是骨科临床应用历史最久、数量最多、范围最广的可注射生物材料。聚甲基丙烯酸甲酯（poly methyl methacrylate,PMMA）历史上最早应用于口腔医学领域,此后逐渐在骨科领域使用,应用范围包括（1）缺损创面填充、关节假体粘合、椎体成形强化、椎弓根螺钉钉道强化等常规填充应用;（2）作为抗生素载药的“金标准”载体,用于清除骨髓炎感染、关节感染翻修旷置、膜诱导技术修复创伤骨缺损等,是骨科感染治疗的标准骨填充材料。虽然PBC是当前骨科临床应用最为广泛且临床应用效果良好的填充材料,但其仍然存在许多缺陷。其中值得关注的PMMA聚合收缩导致界面间隙形成,会造成PBC-骨界面力学不稳定,是假体松动、椎体强化失败的主要原因之一。此外聚合高热、细胞毒性明显、无成骨活性、无骨整合能力等也是PBC的缺陷。当前,上述PBC的临床应用瓶颈仍无有效解决方法,且尚无其他成熟的骨填充材料可充分替代PBC。因此,研发制备改善PBC上述缺陷的替代材料,临床意义至关重要。针对骨水泥体积收缩这一缺陷,课题组通过固-液改性的方法,研发制备了具有吸水自膨胀功能的骨填充材料聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸-苯乙烯（poly methyl methacrylate-acrylic acid-styrene,P（MMA-AA-St））,该材料吸水后能自发膨胀,可以有效解决PBC体积收缩问题。但此自膨胀P（MMA-AA-St）的力学强度相比PBC又有一定的差距。针对这一不足,本课题就如何强化材料力学强度,同时保留材料良好的吸水膨胀性能,并提高材料的骨整合能力的科学问题进行深入的研究,为自膨胀填充材料的进一步临床转化应用提供研究基础。研究目的:实验拟采用生物材料氧化石墨烯（graphene oxide,GO）强化膨胀材料的力学强度,并利用GO良好的生物活性,进一步提升膨胀填充材料的成骨活性,探讨GO促成骨的机制。研究方法:（1）材料的制备与表征:使用分散聚合法制备P（MMA-AA-St）-GO,用拉曼光谱分析、透射电镜、扫描电镜检测合成反应得到的材料。按照引入GO的方法不同,将实验分为三组（1）PMMA骨水泥组（PBC组）、（2）P（MMA-AA-St）聚合GO骨水泥组（PGBCs组）和（3）P（MMA-AA-St）混合GO骨水泥组（PGBCm组）,测试对比三者的吸水性能与膨胀性能。进一步按照ISO5833标准测量PBC、PGBCs和PGBCm吸水前后的力学性能,并对比各组材料的凝固性能。（2）材料的细胞毒性:骨片贴附法从SD胎鼠颅骨分离成骨细胞,并通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、茜素红S（Alizarin Red S,ARS）和Von Kossa染色鉴定成骨细胞。将成骨细胞与PBC、PGBCs和PGBCm的浸提液共培养,通过CCK-8法检测成骨细胞的增殖水平,Live-Dead细胞染色对比细胞的死活数量、流式细胞术检测对比细胞凋亡水平。（3）材料的成骨活性:将成骨细胞接种在预先制备的PBC组、PGBCs组和PGBCm组试样上,培养4和7天后,通过扫描电镜对比观察细胞在材料上的粘附生长情况。进一步通过罗丹明标记的荧光染色,对比观察粘附细胞的形态。通过实时定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）检测对比各组Alp、骨桥蛋白（Osteopontin,Opn）和Smad同源物5（Smad family member 5,Smad 5）的基因表达水平,进一步通过免疫印迹法（Western blot）对比各组OPN和Smad 5的蛋白表达量。（4）材料的体内实验:建立兔股骨髁缺损模型,将上述三组材料植入股骨髁缺损,对比观察材料的生物安全性以及骨整合能力。（1）在材料植入后第0、1、2、3、4周取血样进行血常规和血生化检测,在第4、16周取肺脏、肝脏、肾脏、心脏和材料邻近肌肉进行HE染色,对比观察材料的生物安全性;（2）术后行X线片检查观察材料的填充性能与填充安全性;（3）在术后第4、16周取股骨髁标本行micro-CT扫描,通过微观骨计量参数对比材料周围成骨情况;（4）将第4周股骨髁标本脱钙后行HE和Masson染色,对比各组骨小梁的数量、形态与胶原合成状况;（5）取第16周股骨标本,行硬组织切片VG染色,观察骨与材料的界面间隙以及材料周围骨整合情况。实验结果:（1）材料的制备与表征:（1）拉曼光谱分析发现,GO特征性D峰与G峰出现在P（MMA-AA-St）-GO纳米颗粒光谱上,此外P（MMA-AA-St）聚合GO后ID:IG的比值由0.020上升为0.902,提示P（MMA-AA-St）分子成功聚合在GO上;（2）透射电镜图片结果与拉曼光谱一致,可见P（MMA-AA-St）聚合在GO片层上;（3）扫描电镜结果提示,PMMA、P（MMA-AA-St）和P（MMA-AA-St）-GO均为规则颗粒材料,其中PMMA粒径为20.80±6.20μm,而P（MMA-AA-St）和P（MMA-AA-St）-GO的粒径分别为222.97±52.49 nm和341.83±52.49nm,三组材料粒径均呈正态分布;（4）力学性能测试提示,GO强化后,PGBCs在磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS）浸泡前、后的压缩强度均高于骨水泥标准70MPa,且力学性能优于PGBCm,弹性模量显著下降且与PBC相比差异有统计意义（P＜0.05）;（5）PGBCs仍具有优秀的吸水膨胀性能,吸水和膨胀倍率分别为95.14%和101.18%;（6）PGBCs的凝固温度显著下降（P＜0.05）面团时间延长。（2）材料的细胞毒性:（1）骨片贴附培养1、4、7天后,可见细胞从骨片边缘爬出,经ALP、ARS和Von Kossa染色鉴定为成骨细胞;（2）用材料浸提液干预培养成骨细胞后,第1、4、7天测CCK-8发现PGBCs和PGBCm的细胞毒性比PBC显著降低（P＜0.05）;（3）Live-Dead细胞染色可见,相同倍数视野下,PGBCs的死细胞数量明显少于PBC组;（4）细胞的流式结果提示,PGBCs浸提液培养的成骨细胞凋亡率比PBC组显著降低（P＜0.05）。（3）材料的成骨活性:（1）扫描电镜结果提示,PGBCs和PGBCm材料表面呈珊瑚状,而PBC表明平整,PBC表面生长的成骨细胞细胞呈细条状生长,铺展不佳,而PGBCs和PGBCm表面细胞生长状况良好,铺展面积较大,伪足明显;（2）罗丹明标记的鬼笔环肽染色提示生长在PGBCs表面的成骨细胞铺展良好,细胞骨架清晰;（3）q RT-PCR结果提示,PGBCs和PGBCm上粘附的成骨细胞Alp、Opn和Smad 5基因表达水平高于PBC组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;（4）Western blot结果提示PGBCs和PGBCm上培养的成骨细胞,OPN和Smad 5蛋白表达水平高于PBC组,且有统计学差异（P＜0.05）。（4）材料的体内实验:（1）PBC、PGBCs和PGBCm均具有良好的术中可操作性,术后动物存活与生长状况良好,术后X线片提示三者显影效果良好,材料填充股骨髁缺损后未发生材料渗漏,周围组织无不良反应;（2）术后各组血液学指标无明显统计学差异,HE染色未见三组之间主要脏器和材料周围肌肉的结构异常;（3）Micro-CT扫描分析提示PGBCs周围骨质周围生长状况显著优于PGBCm和PBC组,且差异具有统计学差异（P＜0.05）;（4）脱钙股骨髁HE染色提示PGBCs周围骨小梁数量、厚度均优于PBC和PGBCm组,其中PBC周围骨再生最差,Masson染色显示PGBCs和PGBCm周围骨组织的胶原合成程度明显优于PBC组;（5）股骨髁硬组织切片VG染色提示PBC周围可见明显材料-骨组织间隙存在,而PGBCs和PGBCm材料填充良好,材料-骨组织紧密接触,骨整合状况较好。结论（1）通过引入GO并以聚合反应的方式强化可获得自膨胀材料PGBCs。（2）PGBCs的压缩强度满足丙烯酸类骨水泥植入物标准的要求,同时弹性模量比PBC低,可避免术后因弹性模量过高导致PGBCs植入局部应力集中。此外,PGBCs仍具有较好的吸水膨胀性能,能够改善PBC体积收缩的缺陷。（3）PGBCs的聚合温度降低,可减轻聚合反应热损伤效应,而材料的面团时间较长,使材料的术中可操作性显著提高。（4）细胞实验提示PGBCs的细胞毒性、骨诱导活性显著优于PBC,体内实验进一步证实PGBCs的生物安全性与骨整合能力也优于PBC。综上,聚合GO优化可提高材料的力学性能和生物活性,研究结果可为PGBCs的转化应用提供重要的实验依据。