论文部分内容阅读
近年来,农业经济的飞速发展使农药的广泛使用成为一种新的趋势,这也促进了农药的研发与生产。但由于使用和保管的不当,农药中毒事件屡见不鲜,农药中毒已成为一个不容忽视的社会公共卫生问题。百草枯(Paraquat,PQ)是一种氧化还原除草剂,通过活性氧(ROS)的产生来诱导氧化应激。由于百草枯生产成本较低,使用后见效快,毒性强等特点被发展中国家广泛运用于农业生产中,但多年来人们对百草枯的不当使用,使它成为危害公共健康的主要有机磷农药之一。百草枯进入人体后,可以破坏氧化还原系统,诱导过量自由基产生,导致肺、肾、肝等多个器官不同程度的损伤后逐渐丧失其功能。已有的研究表明,肝脏是PQ暴露损伤的主要靶器官之一。毒物、药物、环境污染物等外源物质在肝脏转化和排泄过程中,诱导多种自由基的产生,当自由基的产生和消耗失去平衡时,过多的自由基可导致肝脏的损伤。百草枯中毒目前尚无特效解毒剂和有效的治疗方法,并且中毒后死亡率非常高。因此,寻找特效的药物和方法治疗百草枯中毒已迫在眉睫。一直以来,传统中药里富含的黄酮类活性成分是备受关注的,以往的研究证明,黄酮化合物能够清除人体自由基,延缓衰老,保护心脑血管系统,抗糖尿病肾病,抗炎,抗肿瘤等功效,因此具有较高的开发和利用价值。黄酮化合物作为药具有毒性小,不良反应少,易开发获得等优势。麦冬(Ophiopogon japonicus)是中国常用和分布广泛的药材,含有多种对人体有益的活性物质。8-醛基麦冬黄烷酮B(8-FOB,8-Formylophiopogonanone B)是一种天然存在于麦冬中的高异黄酮类化合物。在此之前8-FOB拮抗百草枯诱导的肝毒性方面的研究更是未被报道的。所以,本研究旨在运用体内和体外的模型,探究8-FOB预处理对PQ诱导的肝毒性的保护作用及其分子作用机制。主要研究内容和结果如下:1.8-FOB体外拮抗PQ的毒性作用首先,本实验用人的正常肝细胞(L-02 cells)为体外细胞模型。运用CCK-8法检测不同浓度的PQ(0μM,250μM,500μM,750μM,1000μM)分别作用0 h,6 h,12 h,24 h,48 h后的细胞活力,筛选出作用时间为24h浓度为500μM的PQ建立体外肝细胞损伤模型,并计算了PQ作用L-02细胞24 h的IC50。通过光学显微镜记录了不同浓度PQ作用24 h的细胞形态,运用相同的方法评估8-FOB对L-02细胞的毒性和预处理6 h后抑制PQ(500μM)毒性的效果,并计算出8-FOB的EC50。结果显示,PQ作用24 h时随着浓度的增加细胞出现不同程度的变圆皱缩并死亡,计算出的IC50为817.3μM;8-FOB(10μM,40μM)预处理显著提升了PQ(500μM)诱导的细胞活力的降低,在镜下观察的结果显示8-FOB明显降低了PQ对细胞的伤害,半最大有效浓度(EC50)计算得到L-02细胞中8-FOB的是8.057μM,当选高浓度的8-FOB(40μM)单独处理不影响细胞活力,表明8-FOB能有效拮抗PQ的细胞毒性。2.8-FOB改善PQ诱导的氧化应激以及机制接下来我们在500μM的PQ处理L-02肝细胞模型上,有/无8-FOB预处理6 h的情况下对对8-FOB的体外保肝活性和相关机制进行了进一步研究。利用试剂盒在PQ处理3 h后检测了8-FOB对L-02细胞内总ROS和线粒体ROS(mt ROS)含量的影响,并以线粒体靶向抗氧化剂Mito-Tempo和细胞ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)为对照;在PQ施用24 h后,检测线粒体膜电位(ΔΨm)和ATP的水平来评估线粒体功能,检测细胞内脂质过氧化产物丙二醛(MDA)和抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)的变化来评估氧化应激的发生。结果显示,PQ引起细胞和线粒体中ROS过量产生,而8-FOB能够较少过量细胞内总ROS和mt ROS的产生,同样的Mito-Tempo和NAC也降低了细胞内总ROS和mt ROS的水平;其中10μM,和40μM的8-FOB能够有效抑制细胞中脂质过氧化产物MDA的累积,提高细胞内抗氧化酶SOD的活性,有效的抑制细胞中PQ诱导的氧化应激。线粒体功能评估结果显示,8-FOB明显抑制了PQ诱导的线粒体膜电位(ΔΨm)和ATP水平的降低,使线粒体功能得到保护。总之这些结果说明了,PQ破坏L-02细胞中氧化还原系统的平衡,使得线粒体乃至细胞整体的ROS的过量产生,过量的ROS造成线粒体膜电位的闪失和线粒体产能下降,使得线粒体功能紊乱,而8-FOB通过其抗氧化作用来改善PQ诱导的氧化应激,线粒体损伤。3.8-FOB拮抗PQ诱导的L-02肝细胞的凋亡进一步我们通过流式细胞仪器检测到PQ处理24 h后L-02细胞的凋亡率的上升,但用8-FOB预处理使PQ诱导的细胞凋亡率显著下降。我们通过试剂盒检测了8-FOB对细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶Caspase-3的活性的影响;并采用Western blot方法从蛋白表达水平探索了Caspase-3的表达情况。8-FOB拮抗PQ诱导的L-02肝细胞的凋亡的结果显示,PQ诱导细胞中Caspase-3酶的过量表达,提高了其活性,促使L-02细胞的凋亡;然而,8-FOB能够抑制Caspase-3的活性和蛋白表达的增加,降低细胞的凋亡率。总的来说,8-FOB在体外发挥其抗氧化作用,抑制PQ诱导的氧化应激和凋亡,起到了保护L-02细胞的作用。4.8-FOB抑制氧化应激拮抗PQ诱导的小鼠肝损伤为了了解8-FOB在体内是否具有与体外同样的抗氧化和护肝的效果。本实验用25只8周的雄性C57BL/6小鼠(20-24 g),随机分为5个组:对照组(Control),0.5%CMC-Na溶剂对照组(Solvent),8-FOB组,PQ组,8-FOB+PQ组。将8-FOB均匀悬浮于0.5%的CMC-Na中,并以20 mg/kg/day的剂量连续3天对8-FOB组和8-FOB+PQ组进行灌胃,同时以等体积的生理盐水和0.5%CMC-Na溶液灌胃对照组(Control)和溶剂对照组(Solvent)的小鼠。并在第四天以单剂量的PQ(30 mg/kg)对PQ组和8-FOB+PQ组的小鼠进行单次腹腔注射。在腹腔注射PQ 24 h后,检测小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性,肝脏组织用苏木精和伊红(H&E)染色观察组织病理学变化,检测肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽还原酶(GSH)、过氧化氢酶(CAT)和MDA的活性水平,探究8-FOB对PQ诱导的小鼠肝脏损伤的保护作用。体内实验结果表明,8-FOB能有效降低PQ引起的ALT和AST的活性,明显改善小鼠的肝组织病理损害,降低Suzike损伤评分。我们发现单用8-FOB处理并没有引起肝脏氧化应激水平的明显变化,而PQ则导致MDA水平显著升高,GSH和SOD水平显著下降。8-FOB预处理可明显抑制PQ诱导的MDA水平升高和GSH,SOD活性的下降。不同处理组的CAT活性无明显变化,表明CAT活性不敏感。这些结果表明8-FOB在功能和形态学上均能有效地减轻PQ所致的肝损伤,且有效地抑制PQ诱导的肝脏氧化应激。综上所述,本课题对麦冬中黄酮化合物8-FOB的体内外抗氧化能力和保肝能力做了系统的研究。通过对8-FOB拮抗PQ毒性和作用机制的研究,首次证实,8-FOB是一种有效的抗氧化剂,可拮抗体内外PQ诱导的肝毒性;肝脏氧化应激的抑制是8-FOB拮抗PQ诱导的肝毒性的关键因素,其特征是抑制MDA的产生和细胞内及线粒体内ROS的生成,降低GSH和SOD水平,降低PQ对肝脏的损伤。本课题的研究表明因为8-FOB促进了对氧化应激在PQ诱导的肝毒性中的机制作用的理解和对抗性药物的开发,且具有预防PQ毒性的能力,有未来临床应用的潜力。