[目的]基因编辑技术可调节多种细胞功能与特征,并可影响其向特定的方向分化。人脐带间充质干细胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUC-MSCs)分化过程受多种因素调节。本研究通过基因转染技术在hUC-MSCs中过表达miR122、miR185,诱导hUC-MSCs肝向诱导分化后,检测其肝细胞相关因子(AFP、ALB、CK18、CK19、HNF4α)的表达及细胞功能,研究二者单独或协同作用对hUC-MSCs肝向分化的影响。[方法]1、hUC-MSCs细胞培养与鉴定:无菌条件下经组织贴壁法分离培养hUC-MSCs,经流式细胞仪检测细胞表面特异分子CD34、CD45、CD90、CD105以及Oct-4的表达情况。对hUC-MSCs分别进行成脂、成骨条件培养液诱导分化以对其多向分化潜能进行鉴定。2、过表达miR122、miR185以及二者共同转染hUC-MSCs的实验:将鉴定合格的细胞进行分组培养,根据riboFECTM CP转染试剂说明采用不同转染浓度处理细胞,根据q-RT-PCR检测过表达效果以及细胞转染后细胞状态确定miRNA转染浓度。以非处理细胞作为空白对照组,以确定转染浓度单独过表达NC mimic为阴性对照组,以不同miR122、miR185或二者共同浓度转染hUC-MSCs作为实验组。经q-RT-PCR分别检测转染D1、D7、D14、D21、D28后各组miR122以及miR185表达情况,判断过表达效果维持时长,同时记录转染后不同实验组及时间点细胞生长情况。3、miR122,miR185对hUC-MSCs肝向诱导分化的影响的实验:将鉴定合格的细胞进行分组培养,实验分组为空白对照组,空白诱导组,阴性对照诱导组,miR122过表达诱导组,miR185过表达诱导组,miRAB(miR122+miR185)过表达诱导组,共六组。空白对照组在普通培养基中按常规方法培养,其余诱导组按照肝向诱导三步法进行培养。在肝向诱导培养28天后,分别收取各组细胞并对其提取总RNA与总蛋白,进行q-RT-PCR及Western-Blotting实验检测各组AFP、ALB、CK18、CK19、HNF4α在mRNA及蛋白水平的表达情况。利用PAS,ICG胞吞胞吐实验检测肝向诱导28天后各组的细胞功能。[结果]1、hUC-MSCs细胞培养与鉴定:经组织块贴壁法获得hUC-MSCs常规培养至第四代,hUC-MSCs呈长梭形、旋涡状贴壁生长,待细胞80-90%融合,对其进行流式检测。结果显示细胞高表达CD90(99.16%±0.85%)和CD105(99.26%±0.78%),不表达 CD34(0.59%±0.16%)和 CD45(1.50%±2.04%),细胞阳性表达多能干细胞分子标志Oct-4(66.57%±4.61%)。hUC-MSCs经成骨诱导培养28天后,镜下观察可见钙盐沉积,其钙盐沉积经由茜素红染色后呈现致密红色结节。hUC-MSCs经成脂诱导培养28天,镜下可见小圆形脂肪微粒,经由油红O染色后呈现橘红色。说明经组织块贴壁法培养获得的细胞符合hUC-MSCs特异分子表达特性,且具有成骨和成脂分化的潜能。2、在hUC-MSCs中过表达miR122、miR185以及二者共同过表达的实验研究:以不同条件及不同浓度miRNA转染hUC-MSCs,在转染后不同时间点检测细胞miRNA122及miRNA185的表达。结果显示,50 nM为最佳转染浓度,各组miR122和miR185在D1,D7,D14,D21,D28为相对稳定的高水平表达。阴性对照miRNA NC mimic对hUC-MSCs的miR122、miR185的表达无影响。细胞转染培养期间,各组细胞稳定增殖,生长状态良好。3、miR122和miR185对hUC-MSCs肝向诱导分化的影响:转染miRNA122和miRNA185,对hUC-MSC肝向诱导分化后,q-RT-PCR检测结果显示:ALB表达量结果为miR185诱导组(0.47±0.17)与miRAB诱导组(0.36±0.13)低于 BC 诱导组(1.10±0.19)和 NC 诱导组(1.41±0.14)。miR122 诱导组 ALB的表达为(1.72±0.43),与BC诱导组和NC诱导组相比无统计学差异。AFP表达量结果显示,BC诱导组(2.29±0.89)、NC诱导组(2.39±0.94)和miR122诱导组(2.04±0.96)之间无统计学差异。miR185诱导组(0.64±0.27)AFP表达量降低,miR1 85诱导组与miRAB诱导组(0.79±0.53)AFP表达之间无统计学差异。CK18表达检测结果发现,miR122诱导组(1.93 ± 0.21)表达量最高。miR1 85 诱导组(0.21±0.07)与 miRAB 诱导组(0.63±0.21)呈低表达,且 miRAB诱导组CK18表达量略高于miR185诱导组。CK19表达检测结果发现,与BC诱导组(1.13±0.25)相比,miR185 诱导组(0.29±0.28)和 miRAB 诱导组(0.23±0.15)表达量降低,miR122诱导组表达量最高(1.50±0.27)。HNF4α表达检测结果显示,miR122诱导组(19.03±2.13)表达量最高。miR185诱导组HNF4α表达(8.84±2.19)低于miR122诱导组,miRAB诱导组表达量最低(0.58± 0.33)。Western Blotting 结果显示:对比 BC 诱导组,miR122 诱导组 ALB(1.00±0.05)、AFP(0.85±0.03)、CK18(1.13±0.02)、CK19(1.09±0.03)、HNF4α(1.41±0.03)表达升高。对比BC诱导组,miR185诱导组CK18(0.72±0.03)、CK19(0.45±0.02)、HNF4α(0.24±0.02)呈低表达。miRAB 诱导组其 ALB(0.62±0.04)、AFP(0.19±0.02)的表达高于 BC 诱导组。miRAB 诱导组 CK19(0.47±0.03)、HNF4(0.36±0.01)的表达量低于BC诱导,CK18(0.85±0.05)的表达量与BC诱导组对比无统计学意义。4、肝向诱导分化后,细胞功能检测试验结果。PAS染色实验结果发现,BC组无糖原沉积,其他诱导组可见糖原聚集情况。对比五组诱导组可见,BC诱导组与NC诱导组糖原聚集量相近,miR122诱导组则出现大量的糖原沉积,高于BC诱导组和NC诱导组。miR185诱导组其糖原含量少于BC诱导组和NC诱导组,miRAB诱导组糖原聚集较多,与BC诱导组和NC诱导组相近。ICG胞吞胞吐实验中,BC组无ICG胞吞出现,对比其余五组诱导组可发现,BC诱导组与NC诱导组ICG染料胞吞结果相近,miR122诱导组则出现大量的ICG染料,高于BC诱导组和NC诱导组。miR185诱导组其ICG染料胞吞情况少于BC诱导组和NC诱导组。miRAB诱导组ICG染料胞吞情况略少于BC诱导组和NC诱导组,但较miR1 85诱导组略多。[结论]1、经组织块贴壁法培养获得的细胞符合hUC-MSCs特异分子表达特性,且具有多向分化潜能。2、50 nM miR122和miR185为最佳转染浓度,hUC-MSCs过表达miR122和miR185后,其过表达效果可维持28天。3、过表达miR122可促进hUC-MSCs的成肝分化,过表达miR185可能抑制hUC-MSCs的成肝分化,两者共同作用时,对成肝分化的影响可部分相互抵消。因此,通过转染或其他基因修饰技术使某些miRNA在细胞中过表达可能成为调节干细胞分化的有效途径。