论文部分内容阅读
目的:（1）了解江苏淮安食管癌高发区村民N-亚硝基化合物（NOC）前体物亚硝酸盐的暴露水平及血浆维生素C（VC）的水平。（2）N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）染毒人正常食管上皮细胞（HEEC）,探讨其对食管细胞的毒性作用,进一步探讨其相关机制。（3）用不同浓度维生素C及MNNG同时干预HEEC,探讨维生素C对MNNG致食管细胞毒性的干预作用。方法:（1）问卷调查收集调查对象一般情况、生活饮食习惯及膳食频率,双份饭法收集三天的膳食以检测膳食亚硝酸盐的含量,收集血液样品以检测血浆亚硝酸盐及维生素C的含量。将各检测指标与现有标准比较并分析其与社会人口学特征、部分膳食频率的关系。（2）HEEC暴露于0、5、10、20、40、80、160μmol/L的MNNG 24、48、72 h后,检测其对HEEC活性的影响,随后用0、5、10、20μmol/L的MNNG染毒24 h后检测MNNG对HEEC膜完整性（LDH）、胞内总活性氧（ROS）水平的影响,通过流式细胞术检测MNNG对HEEC凋亡及周期的影响,实时荧光定量PCR检测凋亡和周期有关的基因P53、Bcl-2/Bax、CDC25C、Cyclin B1、CDK1、和CDC25A m RNA的表达,Western blot法检测P53、CDC25C、Cyclin B1、CDK1、p-CDK1（Tyr 15）蛋白的表达水平,探讨相关机制。（3）CCK8法检测0、1、10、100、1000μmol/L的维生素C干预,以及不同浓度维生素C和20μmol/L MNNG共同干预对HEEC活力的影响,随即用0、0.1、1、10μmol/L的维生素C以及20μmol/L MNNG共同干预HEEC,24 h后进行ROS、凋亡、周期的检测,观察维生素C对MNNG致HEEC毒性的影响,并通过实时荧光定量PCR检测P53、Bcl-2/Bax、CDC25C、Cyclin B1、CDK1 m RNA的表达,Western blot法检测P53、CDC25C、Cyclin B1、CDK1、p-CDK1（Tyr 15）蛋白的表达,探讨维生素C作用的机制。结果:1.江苏淮安食管癌高发区亚硝酸盐暴露及维生素C的摄入水平:本次调查184人,51.1%为男性,男女性在生活习惯上差异均有统计学意义（P<0.05）,各项饮食习惯、膳食频率均无统计学意义（P>0.05）。亚硝酸盐内外暴露在性别之间无统计学差异（P>0.05）。不同社会人口学特征的亚硝酸盐内外暴露水平均无差异（P>0.05）。膳食亚硝酸盐超标率达69.6%,男女性之间差异无统计学意义（P>0.05）。腌晒制品摄入频率及饮水来源对膳食亚硝酸盐超标率及血浆亚硝酸盐的含量无影响（P>0.05）。血浆维生素C缺乏占42.4%,不足占23.9%,正常者占33.7%,腌晒制品摄入频率不同的村民血浆维生素C含量差异有统计学意义（P<0.01）。2.MNNG对HEEC毒性及机制研究:（1）当HEEC暴露于不同浓度MNNG 24、48、72h后,细胞活力逐渐下降,呈时间、剂量依赖性。（2）0、5、10、20μmol/L MNNG染毒HEEC24 h后,随着浓度升高,LDH释放明显增多,与对照组相比,各组差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）ROS检测显示,MNNG明显增加了ROS产生,其中10、20μmol/L MNNG组的ROS荧光强度与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（4）凋亡检测结果显示,MNNG促进了HEEC凋亡,各组总凋亡率均明显增加（P<0.05）,呈剂量依赖性。（5）细胞周期结果显示,与对照组相比,各染毒组G0/G1期细胞减少,S期比例增高,差异具有统计学意义（P<0.05）,20μmol/L MNNG组S期细胞及G2/M细胞增多（P<0.05）。（6）RT-q PCR结果显示:P53 m RNA的表达升高,Bcl-2/Bax m RNA表达下降,10、20μmol/L MNNG组与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比,各组CDC25C m RNA的表达降低（P<0.01）,Cyclin B1 m RNA表达降低（P<0.05）,CDK1 m RNA表达升高（P<0.01）、CDC25A m RNA表达升高（P<0.05）。（7）Western blot法检测结果显示:P53蛋白表达随着浓度逐渐升高,CDC25C蛋白表达逐渐降低,Cyclin B1蛋白表达也逐渐降低,10、20μmol/L MNNG组与对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。而CDK1和p-Tyr 15的蛋白表达上升,各组明显高于对照组（P<0.05）。3.维生素C对MNNG染毒的HEEC的影响及机制研究:（1）HEEC暴露于不同浓度维生素C后,结果显示维生素C对HEEC活力无明显影响（P>0.05）。不同浓度的维生素C与20μmol/L MNNG同时处理,发现维生素C可以抑制MNNG对HEEC活力的影响,当浓度为1、10μmol/L时差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）采用0、0.1、1、10μmol/L维生素C与20μmol/L MNNG同时干预,ROS检测显示维生素C可以减少MNNG产生的ROS,荧光强度降低（P<0.05）。（3）维生素C还可降低MNNG升高的总凋亡率（P<0.05）。（4）细胞周期检测结果显示:与MNNG染毒组相比,1μmol/L VC+MNNG组、10μmol/L VC+MNNG组G0/G1期细胞均有所增多（P<0.01）,各组S期比例均有所降低（P<0.05）,G2/M细胞也均降低（P<0.05）。（5）RT-q PCR检测结果显示维生素C干预可以降低P53 m RNA的表达,其中1μmol/L VC+MNNG组、10μmol/L VC+MNNG组均明显低于MNNG染毒组（P<0.01）。与MNNG染毒组相比,1μmol/L VC+MNNG组、10μmol/L VC+MNNG组Bcl-2/Bax m RNA升高（P<0.05）。CDC25C m RNA的表达经维生素C干预后升高,含维生素C的组别均明显高于MNNG染毒组（P<0.01）。含维生素C的组别Cyclin B1 m RNA表达相对于MNNG染毒组升高,差异有统计学意义（P<0.01）。与MNNG染毒组相比,0.1μmol/L VC+MNNG组CDK1 m RNA表达明显升高（P<0.01）,1μmol/L VC+MNNG组、10μmol/L VC+MNNG组CDK1 m RNA表达明显降低（P<0.01）。（6）Western blot法检测结果显示:维生素C降低了MNNG上调的P53蛋白的表达,与MNNG染毒组相比差异有统计学意义（P<0.01）。与MNNG染毒组相比,有维生素C干预的组别CDC25C蛋白表达略有升高,但差异均无统计学意义（P>0.05）。经MNNG染毒后,Cyclin B1蛋白表达明显降低（P<0.01）,有维生素C干预的组别,Cyclin B1蛋白表达逐渐升高,其中10μmol/L VC+MNNG组较MNNG染毒组明显升高（P<0.01）。与空白对照组相比,MNNG染毒组CDK1蛋白表达略微升高,差异无统计学意义（P>0.05）,但0.1μmol/L VC+MNNG组CDK1蛋白表达明显升高（P<0.01）,而1μmol/L VC+MNNG、10μmol/L VC+MNNG组CDK1逐渐降低,10μmol/L VC+MNNG组与MNNG染毒组相比差异有统计学意义（P<0.01）。p-CDK1（Tyr 15）蛋白表达呈现与CDK1相似的趋势,先升高后降低,也在0.1μmol/L VC+MNNG组最高,不同的是1μmol/L VC+MNNG、10μmol/L VC+MNNG组均降低至低于对照组表达水平（P<0.01）。结论:（1）江苏淮安地区亚硝酸盐暴露超标,维生素C摄入缺乏严重。血浆维生素C含量与腌晒制品摄入频率有关。（2）MNNG抑制HEEC活力,呈时间和剂量依赖性,还可致细胞膜完整性破坏,增加细胞内ROS的产生,且可促进细胞凋亡,凋亡呈剂量依赖性,促凋亡作用与P53表达上调,Bcl-2/Bax m RNA表达下调有关。MNNG通过CDC25C/CDK1/Cyclin B1通路将细胞周期阻滞在G2/M期,体现在Cyclin B1,CDC25C蛋白表达的下调以及CDK1和p-CDK1（Tyr15）蛋白表达的上调。（3）维生素C对HEEC的活力无影响,维生素C可以减弱MNNG对细胞活力的抑制,减少ROS的产生,抑制其凋亡作用,以及减少细胞G2/M期阻滞。抑制细胞凋亡作用与下调P53表达,上调Bcl-2/Bax m RNA表达有关。减轻周期阻滞主要是通过调控CDC25C/CDK1/Cyclin B1通路,具体表现在上调MNNG引起的Cyclin B1,CDC25C的蛋白表达下调,降低MNNG导致的CDK1和p-CDK1（Tyr15）蛋白表达升高。