论文部分内容阅读
第一部分目的分离获得单核细胞,进而极化成不同极化状态的巨噬细胞,研究不同极化状态的巨噬细胞对肝癌细胞增殖、侵袭、迁徙、促血管生成能力的影响。方法应用梯度离心的方法分离外周血单核细胞,通过不同极化剂极化单核细胞成不同极化状态的巨噬细胞。迁徙实验中,将不同极化状态的巨噬细胞上清液加至肿瘤细胞中,24小时后观察细胞生长趋势,判断不同极化状态的巨噬细胞对肿瘤迁徙能力的影响;侵袭实验中,将肝癌细胞在Transwell体系中与不同极化状态的巨噬细胞进行共培养,指定时间内观察穿透基质胶进入下室的肝癌细胞的数量;将不同极化状态的巨噬细胞上清液与不同肝癌细胞进行共培养,观察共培养体系中肿瘤细胞中VEGF(PCR,WB检测)的表达情况。结果在迁徙实验中,相同时间内,与M2型巨噬细胞上清液共培养的肝癌细胞较与M1型巨噬细胞上清液共培养的肝癌细胞和空白对照组肝癌细胞迁徙能力明显增强。在Transwell实验中,与M2型巨噬细胞共培养的肝癌细胞较与M1型巨噬细胞共培养的肝癌细胞有更强的侵袭力。增殖方面,与不同极化状态的巨噬细胞的上清液共培养,发现M2型巨噬细胞较M1型巨噬细胞更能促进肝癌细胞的增殖。促血管生成方面,M2型巨噬细胞较M1型巨噬细胞促进共培养体系中VEGF-A的表达更强(Western-Blot,RT-PCR);同时MMP-9(金属基质蛋白酶-9)的表达在M2共培养体系中较M1共培养体系中强(Western-Blot,RT-PCR),两组较单独肝癌细胞对照组的表达增强。结论M2型巨噬细胞较M1型巨噬细胞更能促进肝癌恶性转化。第二部分目的本研究对TAMs进行分型分析,拟探讨不同极化状态的巨噬细胞对肝癌病人预后的影响。方法分别对巨噬细胞两种类型(M1,M2)进行间接免疫荧光染色(CD68+HLA-DR+,CD68+CD163+),联系病人术后随访资料及临床病理指标,绘制生存曲线,分析不同类型的巨噬细胞对肝癌病人预后的影响。结果免疫荧光结果分析结合Cox风险回归模型分析显示,M2型巨噬细胞是肝癌病人独立的预后不良因素,与病人的预后呈负相关。将M2的密度中位值作为高、低组的分界点,生存曲线显示M2型低表达组有着更长的生存预后时间的和更高的生存率。结论M2型巨噬细胞是肝癌病人的不良预后因素,M2型巨噬细胞较M1型巨噬细胞更能促进肿瘤的恶性进展。第三部分目的探讨肿瘤相关巨噬细胞与血管内皮生长因子-A、金属基质蛋白酶-9、核因子-κB p50之间的关系。方法对肝癌病理标本进行巨噬细胞、金属基质蛋白酶-9、血管内皮生长因子-A、核因子-κB进行免疫组化染色,分析与巨噬细胞表达是否相关,其对病人预后的影响。结果MMP-9、VEGF-A、核因子-κB p50的表在肝癌病人中存在差异,MMP-9、VEGF高表达的病人术后生存期较低表达组短。M2型巨噬细胞较M1型巨噬细胞与金属基质蛋白酶、VEGF-A、核因子-κB p50的表达有更强的相关性。结论M2型肿瘤相关巨噬细胞更能促进肿瘤微环境中VEGF-A、MMP-9、核因子-κB的表达,利于肝癌的侵袭和转移。