【摘 要】
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玉米是我国的主要粮食作物,其高产、稳产关系到国计民生。生产上,玉米病害是玉米减产的重要原因,最为常见的玉米叶部病害,如玉米小斑病、玉米大斑病、玉米锈病等。为探索玉米病害的绿色防控技术,论文通过ds RNA提取和高通量测序等方法检测了玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)中的真菌病毒多样性,验证了玉米小斑病菌真菌病毒种群中弱毒真菌病毒BmPV1(Bipolaris maydis parti
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玉米是我国的主要粮食作物,其高产、稳产关系到国计民生。生产上,玉米病害是玉米减产的重要原因,最为常见的玉米叶部病害,如玉米小斑病、玉米大斑病、玉米锈病等。为探索玉米病害的绿色防控技术,论文通过ds RNA提取和高通量测序等方法检测了玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)中的真菌病毒多样性,验证了玉米小斑病菌真菌病毒种群中弱毒真菌病毒BmPV1(Bipolaris maydis partitivirus1)基因组核酸ds RNA2编码病毒的外壳蛋白。在此基础上,进一步通过酵母双杂交技术探索该病毒外壳蛋白与寄主因子的互作,为解析病毒引起弱毒现象的机理奠定了基础。具体研究结果如下:采集了武汉市汉南区玉米小斑病叶片样品,通过单胞分离法分离获得293个玉米小斑病菌菌株。菌株ds RNA提取结果显示该地区的玉米小斑病病菌种群中ds RNA条带呈现丰富的多样性,说明可能存在多种真菌病毒。选取ds RNA条带具代表性的25个菌株进行了高通量测序。测序结果显示这25个菌株中包含35种病毒,其中包含了9种ds RNA病毒、19种单链RNA病毒,这19种病毒分属8个科,以及7种未分类的病毒新株系。此外,35种病毒中,有12种可能为新病毒。制备BmPV1 ds RNA2可能编码蛋白P2的多克隆抗体,通过病毒粒子提取、SDS-PAGE、Western Blot等实验检测了P2蛋白的生物学功能。结果显示:在病毒粒子、含BmPV1菌株中均能检测到P2蛋白的存在,而在对照菌株(不含BmPV1菌株)、脱毒菌株中不能检测到P2蛋白的存在,说明P2蛋白即为病毒的外壳蛋白(Coat protein)。以BmPV1的P2作为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选了玉米小斑病菌的c DNA文库,获得了150个阳性克隆。阳性克隆测序结果显示46个寄主因子可能与BmPV1的外壳蛋白互作。选择其中感兴趣的的10个基因,进行全长克隆和进一步酵母双杂交验证,结果显示10个寄主因子有2个与BmPV1的外壳蛋白互作,这两个寄主因子分别为烯醇化酶和前体m RNA加工因子。此外,鉴于弱毒真菌病毒BmPV1能引起玉米小斑病菌黑色素合成减少,通过酵母双杂交技术分析了玉米小斑病菌黑色素通路的9个关键因子与BmPV1外壳蛋白之间的互作关系。结果显示:病原菌黑色素通路9个关键因子中多铜氧化酶(Bz Mco1)能够与BmPV1外壳蛋白互作。这些互作关系,说明BmPV1的P2除作为病毒结构蛋白外,还可能在病毒侵染、寄主黑色素合成减少等过程中起到关键的作用。
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