菌斑生物膜是黏附于牙齿表面的微生物团体,是龋病发生的始动因子。生物膜中细菌的基因表达和表型明显不同于浮游细菌,对抗生素具有较强的抵抗力。变形链球菌是公认的致龋菌,变链素(mutacin)是由变形链球菌所产生的具有抑菌效果的细菌素。它有抑制与本菌不同株或不同型以及其它类型相近的细菌的生长,以维持其本身生存需要的作用,也是细菌在生存中的一个重要竞争手段。本实验通过固相合成技术、抑菌实验技术、动物实验技术,人工合成了mutacinⅠ、Ⅲ及组成它们的8条短肽的一级结构,并对其进行抑菌活性检测,为进一步的应用研究奠定了基础。1.mutacinⅠ、Ⅲ多肽及短肽的设计合成研究本实验采用Fmoc固相多肽合成技术人工合成变形链球菌多肽Ⅰ、Ⅲ型mutacin及8条短肽。使用高效液相色谱仪分析提纯,使用质谱法碎片结构分析技术,对合成产物进行检测。结果表明,准确合成了Ⅰ型的全部24及Ⅲ型的全部22个氨基酸序列,准确纯度达80%,即具有抑菌活性。经质谱数据分析,峰值与初始分子量的误差< 2‰,说明多肽合成成功(短肽合成与鉴定技术同上)。成功合成变形链球菌Ⅰ、Ⅲ型mutacin多肽及短肽,为多肽防龋疫苗研究提供了基础。2.mutacinⅠ、Ⅲ及短肽的体外抑菌研究本实验研究人工合成mutacinⅠ、Ⅲ及短肽对牙菌斑主要致龋菌的抑制作用,寻找其活性基团。采用二倍稀释法检测系列短肽对变形链球菌和血链球菌的最小抑菌浓度,并检测其对变形链球菌、血链球菌、韦荣氏菌、粘性放线菌、内氏放线菌、远缘链球菌的抑菌圈直径大小。结果显示人工合成mutacinⅠ及Ⅲ及部分短肽类似物对变形链球菌、远缘链球菌、血链球菌有抑菌活性。mutacinⅠ、Ⅲ对变形链球菌的最小抑菌浓度为50%,即浓度在0.5mmol/ml以上具有抑菌能力,而合成的短肽对于变形链球菌没有抑制作用。mutacinⅠ对血链球菌无抑菌效果,mutacinⅢ对血链球菌的最小抑菌浓度为50%,3号短肽与8号短肽对血链球菌的最小抑菌浓度为50%,其他短肽对血链球菌均无抑菌作用。根据其抑菌活性,可初步确定其活性基团位置。3.mutacinⅠ、Ⅲ中具有活性的短肽的体内抑菌实验研究通过应用mutacinⅠ、Ⅲ中活性短肽,观察大鼠口内的菌斑生长情况。本实验选用SD大鼠,适应性喂养一周(接种链球菌)后,随机分为4组,定期涂擦实验药物。观察4组大鼠上颌磨牙在擦药前和擦药2周后的菌斑面积变化,用Photoshop软件和VC++6.0软件做菌斑面积统计,最后用SPSS统计软件检验。结果显示活性短肽组大鼠在擦药后牙面上菌斑面积明显小于涂药前。肉眼观察,牙龈无红肿。根据结果可以推断,具有活性的多肽在大鼠体内能够抑制牙菌斑的生长,并无粘膜毒性。