肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤,死亡率居所有恶性肿瘤死亡率的第二位。肝癌的复发转移是导致肝癌患者死亡率高居不下的主要原因,揭示肝癌转移的相关分子机制已经成为提高肝癌临床治疗效果和延长肝癌患者寿命的关键。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是指肿瘤发生发展的局部病理环境。肿瘤的发生发展和复发转移不仅由恶性肿瘤细胞自身决定,而且与肿瘤微环境中非肿瘤细胞成分密切相关,肿瘤微环境已经成为癌症基础研究领域的热点。肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage,TAM)是肿瘤微环境中众多炎症细胞的主要成员,约占炎症细胞总数的30%-50%。肿瘤微环境中浸润的高密度TAM主要是M2型肿瘤相关巨噬细胞。本研究中,我们在体外诱导培养M2型肿瘤相关巨噬细胞的基础上,采用BioLevitatorTM三维细胞培养仪,模拟体内肿瘤微环境在体外建立M2型肿瘤相关巨噬细胞与肝癌细胞的立体共培养体系；运用iTRAQ与质谱相结合的定量蛋白质组学技术,建立M2型肿瘤相关巨噬细胞与肝癌细胞立体共培养体系外分泌蛋白质的差异表达谱；基于生物信息学分析技术结合文献报道筛选其中的关键差异蛋白质分子,明确其对肝癌转移功能的影响,并进一步采用RT-PCR和Western blot等技术深入探讨其促进肝癌转移的分子机制。本研究旨在从蛋白质组学的角度阐明M2型肿瘤相关巨噬细胞促进肝癌转移的分子机制,为今后肝癌转移的靶向治疗提供新思路。第一部分M1和M2两种极化的巨噬细胞模型的体外诱导与鉴定巨噬细胞由血液中的单核细胞分化而来,是机体免疫系统的重要组成部分,在机体特异性免疫防御和非特异性免疫防御中均发挥重要作用。巨噬细胞是一类动态变化的免疫细胞群,表型的异质性和功能的多样性是其主要的特征。巨噬细胞在不同的微环境能够发生不同性质的活化,分化成为具有不同表型标志物和功能特征的细胞亚群。研究表明,巨噬细胞的极化主要包括两种类型：一种是经典激活的巨噬细胞(classic activation of macrophage,M1),另一种是替代激活的巨噬细胞(alternative activation of macrophage,M2)。本部分旨在体外建立M1和M2两种极化的巨噬细胞模型,为后继的研究奠定基础。我们在使用佛波酯(PMA)将人单核细胞白血病细胞THP-1体外诱导分化成为未分化的巨噬细胞(unactivated macrophage, UaM)的基础上,选用脂多糖(LPS)和IFN-γ为M1型巨噬细胞的诱导剂,选用IL-4和IL-13为M2型巨噬细胞的诱导剂,使用倒置相差显微镜观察诱导后的细胞形态变化,采用流式细胞术(FCM)检测M1和M2两种巨噬细胞表面分子CD68、CD206和CD163的表达水平,用ELISA检测M1和M2两种巨噬细胞培养上清液中IL-10和IL-12的分泌水平,用荧光定量PCR检测M1和M2两种巨噬细胞不同表型分子标志物TNF-α、CCL3、iNOS、 Arg-1、AMAC-1和CCL22 mRNA的相对表达水平。结果显示,M1型巨噬细胞呈不规则形或者长梭形,高表达IL-12、TNF-α CCL3和iNOS;M2型巨噬细胞多呈圆形或类圆形,抱团生长,高表达IL-10、CD206、CD163、Arg-1、 AMAC-1和CCL22,研究结果与文献报道相符,表明我们成功建立了M1和M2两种极化的巨噬细胞模型。第二部分M2型肿瘤相关巨噬细胞在肝癌细胞侵袭和上皮间质转化中的作用研究上皮间质转化(Epithelial mesenchymaltransition,EMT)是上皮源性肿瘤转移的首要步骤,已成为肿瘤转移研究的焦点。肝癌是一种典型的上皮源性肿瘤,复发、转移和缺乏有效的治疗手段是导致其高死亡率的主要原因,转移复发已经成为提高肝癌治疗效果与生存率的最大障碍。肿瘤的发生发展和复发转移不仅由恶性肿瘤细胞自身决定,而且与肿瘤微环境密切相关。肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞主要是M2型肿瘤相关巨噬细胞。本部分主要研究M2型肿瘤相关巨噬细胞对肝癌细胞侵袭、迁移和粘附能力以及上皮间质转化的影响,探讨M2型肿瘤相关巨噬细胞在肝癌转移中的作用。我们在体外将人单核白血病细胞THP-1诱导分化成为M2型肿瘤相关巨噬细胞的基础上,采用transwell小室建立M2型肿瘤相关巨噬细胞与肝癌细胞Huh7和SMMC7721的共培养体系,利用侵袭实验、迁移实验和粘附实验检测共培养后Huh7和SMMC7721细胞侵袭、迁移和粘附能力的变化,用荧光定量PCR检测共培养前后Huh7和SMMC7721细胞EMT相关标志物E-cadherin,N-cadherin,Vimentin和α-smooth muscle actin (α-SMA) mRNA的相对表达水平。结果显示,与M2型肿瘤相关巨噬细胞共培养48 h后,肝癌细胞Huh7和SMMC7721形态发生了明显的变化,由原来上皮细胞形态转变成为一种梭形的间质细胞形态,细胞的侵袭和迁移能力增强,而粘附能力下降。荧光定量PCR显示,共培养后Huh7和SMMC7721细胞上皮标志物E-cadherin mRNA相对表达水平下降,间质标志物N-cadherin,Vimentin和α-SMA mRNA相对表达水平上升,表明M2型肿瘤相关巨噬细胞通过诱导肝癌细胞发生EMT促进肝癌细胞侵袭。第三部分M2型肿瘤相关巨噬细胞与肝癌细胞的三维立体共培养体系的建立及关键差异蛋白的筛选与验证分泌蛋白质组(secretome)是指在一定的时间和空间条件下,组织和细胞等分泌的全部蛋白质。分泌蛋白质组学(Secretomics)是指利用蛋白质组学(proteomics)技术对分泌蛋白质进行广泛和深入的研究。肿瘤微环境中的肿瘤细胞与间质细胞相互作用,相互影响,共同决定了肿瘤细胞的归宿。在肿瘤细胞与间质细胞相互作用的过程中,肿瘤微环境中的分泌蛋白质充当了“桥梁”的作用,其功能网络是维持肿瘤与间质稳态,决定肿瘤发生发展的重要媒介。本部分中,我们应用BioLevitatorTM三维细胞培养仪,模拟体内肿瘤微环境在体外建立M2型肿瘤相关巨噬细胞与肝癌细胞的立体共培养体系；运用iTRAQ与质谱相结合的定量蛋白质组学技术,建立M2型肿瘤相关巨噬细胞与肝癌细胞立体共培养体系外分泌蛋白质的差异表达谱；采用生物信息学分析技术结合文献报道筛选其中的关键差异蛋白质分子,并使用Western blot对部分关键差异蛋白质分子进行表达验证,为进一步深入探讨肿瘤微环境中M2型肿瘤相关巨噬细胞与肝癌细胞的相互作用,阐明M2型肿瘤相关巨噬细胞促进肝癌转移的分子机制提供实验依据。第四部分巨噬细胞源性IL-1β对肝癌细胞转移功能的影响及其分子机制研究肝癌是一种经典的炎症伴随肿瘤,病因以慢性肝炎病毒感染为主,具有慢性炎症改变和免疫调节紊乱两大病变基础。随着慢性炎症在肿瘤发生发展中的作用得到进一步解析,炎症与肿瘤转移的关系已经引起广泛关注。白细胞介素1β (interleukin 1β, IL-1β)是体内炎症反应和免疫调节的核心介质,主要由炎症状态下或免疫反应中巨噬细胞和单核细胞产生,其对肝癌转移功能的影响及相关机制尚不明确。本部分中,我们使用外源性重组人IL-Iβ诱导培养肝癌细胞SMMC7721,采用侵袭实验、迁移实验和粘附实验检测IL-1β对肝癌细胞SMMC7721侵袭能力、迁移能力和粘附能力的影响,用荧光定量PCR检测EMT相关标志物maRNA的相对表达水平,用Western blot检测IL-1β诱导不同时间点SMMC7721细胞NF-κB通路信号分子NF-κB(p65,胞核)、IκBα(胞浆)和P-IκBα(胞浆)以及EMT相关标志物Snail的蛋白表达水平。结果显示,IL-1β诱导48 h后,SMMC7721细胞形态发生了明显的变化,细胞向成纤维细胞样梭形改变；细胞的侵袭和迁移能力增强,粘附能力下降；细胞上皮标志物E-cadherin mRNA表达水平下降,间质标志物N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、ZEB1和ZEB2 mRNA表达水平上升；Western blot结果显示IL-Iβ诱导后NF-κB(p65,胞核)、P-IκBα(胞浆)和Snail蛋白表达上调,IκBα(胞浆)蛋白表达下调,并且具有明显的时间依赖性。另外,NF-κB通路特异性抑制剂BAY11-7082处理能够减弱甚至逆转IL-1β对肝癌细胞SMMC7721转移潜能及EMT的促进作用。研究结果表明,IL-1β通过NF-κB/Snail途径诱导肝癌细胞发生EMT,进而促进肝癌细胞的转移潜能,阻断NF-κB通路能够显著降低IL-1β对肝癌细胞转移潜能的促进作用,IL-1β可能是肝癌转移的潜在治疗靶点。结论1.体外成功诱导并建立了M1和M2两种极化的巨噬细胞模型。2.M2型肿瘤相关巨噬细胞主要通过诱导肝癌细胞发生EMT增强肝癌细胞侵袭和转移的潜能。3.成功应用BioLevitatorTM三维细胞培养仪模拟体内肿瘤微环境在体外建立了M2、SMMC7721以及M2+SMMC7721的三种立体培养体系,并运用iTRAQ与质谱相结合的定量蛋白质组学技术,建立了三种立体培养体系外分泌蛋白质的差异表达谱,其中IL-1β是M2型肿瘤相关巨噬细胞与SMMC7721细胞共培养相互诱导产生的关键差异蛋白质分子,与肿瘤转移密切相关。4.IL-1β主要通过参与调节NF-κB/Snail信号通路影响肝癌细胞的EMT进程,最终发挥其促进肝癌细胞转移潜能的功能,IL-1β是肝癌转移的潜在治疗靶点。