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布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引起的一种广泛流行、人畜共患的慢性传染病,不仅给畜牧业造成重大经济损失,而且严重危害着人们的健康。目前,疫苗接种是预防该病的主要手段。我国自主研制的M5-90疫苗株对预防绵羊和山羊布鲁氏菌病起到了积极的作用,但由于无法区别自然感染和疫苗免疫,给布病的临床血清学诊断和流行病学调查等造成了障碍,加之该疫苗毒力强、容易引起怀孕母畜的流产等缺点,使得该疫苗的应用受到很大限制。为此,本研究开发了一种有效区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌弱毒基因缺失疫苗,为布鲁氏菌病的防控提供技术支持。以热灭活的布鲁氏菌M5-90为模板,分别扩增WboA基因和pgm基因的上下游同源臂序列,以枯草杆菌和pEGFP-N1质粒为模板,分别扩增SacB基因和gfp基因,将扩增序列连接]pMD18-T simple载体,双酶切后将上下游同源臂序列和gfp基因连接至自杀载体pGEM-7Zf上,分别得到pGEM-7zf-△WboA和pGEM-7zf-△pgm-gfp,再将SacB基因单酶叨后分别连接至以上两个载体中,电转化布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选△WboA和Δpgm基因缺失株,以小鼠为试验动物,进行缺失株的毒力评价；分别用3.0×106CFU剂量的△WboA、△pgm和M5-90疫苗株接种BALB/c小鼠,用ELISA方法检测小鼠外周血血清中抗体IgG及细胞因子IL-2、IFN-y的含量；用流式细胞仪对小鼠外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞进行分析,并对免疫30大后的小鼠进行攻毒试验评价其免疫保护性；根据GenBank中发表的羊种布鲁氏菌16M的WboA基因和pgm基因序列设计引物,用PCR方法扩增M5-90的WboA基因和pgm基因的编码序列,克隆到原核表达载体pET-28a,导入人肠杆菌DE3诱导表达,将获得的目标蛋白用Ni-NTA Agarose试剂盒进行纯化,并进行Western blot分析；将纯化的WboA蛋白和pgm蛋白作为抗原,用M5-90、△WboA和Δpgm疫苗免疫的小鼠血清作为一抗进行Western blot分析,检测△WboA和Δpgm疫苗免疫的小鼠血清中是否存在抗WboA蛋白和pgm蛋白的抗体。用虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测免疫小鼠的抗体水平。成功构建并筛选了遗传稳定的布鲁氏菌疫苗株M5-90ΔWboA缺失株和Δpgm缺火株,15代内未发生回复突变。布鲁氏菌M5-90△WboA基因缺失株比亲本株M5-90的毒力明显减弱且免疫保护性略低于亲本株,Δpgm基因缺失株与亲本株的毒力相当但免疫保护性高于亲本株；成功表达并纯化了WboA蛋白和pgm蛋白,Western Blot证实ΔWboA基因缺火株和Δpgm基因缺失株不能诱导小鼠产生抗WboA蛋白和抗pgm蛋白的抗体：两株基因缺失株采用虎红平板凝集试验和试管凝集试验不发生凝集反应。