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在严重烫伤患者,早期及后续病程中常伴有腹部胀气、肠鸣音减弱或消失、肠麻痹等胃肠道运动障碍的表现。以往研究者多将这些症状归因于:烫伤后应激反应性高血糖,及其所引起的下丘脑饱感中枢抑制;交感神经系统过度兴奋;伤后血中儿茶酚胺浓度增高,使得肠肌紧张性减弱、运动受到抑制;肠管壁内某些脑啡肽的释放;低钾血症导致平滑肌细胞膜超极化等[1]。而对于烫伤后是否伴有胃肠道平滑肌细胞的节律性电活动(由其引发平滑肌的节律性舒缩运动)的产生机制及其相关调控因子的改变,尚少见研究报道。
Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal,ICC)是一种广泛分布于哺乳动物胃肠道的特殊间质细胞。除了作为起搏细胞,自发地产生并传导节律性的去极化波(慢波),从而引发胃肠平滑肌的规律性收缩外[2],它还参与了植物神经、肠神经和某些胃肠激素对胃肠运动的调节过程,并与胃肠道间质细胞瘤的发生密切相关。已经知道,一些伴有胃肠道动力减退表现的疾病如:胃食管反流病、慢传输型便秘、糖尿病性胃轻瘫等,都不同程度的伴有Caial间质细胞形态、结构和功能的损害,且其受损程度与胃肠道运动功能减退的轻重有关。而对于严重烫伤后肠道Caial间质细胞的形态、功能、其影响调控因子的改变,以及与胃肠道动力障碍之间关系的研究迄今还较少见到。
目的:通过测定7cm×4cm面积的Ⅲ度烫伤大鼠的肠道推进速率,结肠组织中三种与Cajial间质细胞的平滑肌电起搏活动相关的蛋白基因-Kit(编码ICC胞膜上具酪氨酸蛋白激酶活性的c-kit受体)、Kitl(编码c-kit的配体—干细胞因子SCF)及Gjal(慢波产生与传导所必需的缝隙连接蛋白Cx43的编码基因)相应mRNA的表达水平,探讨烫伤对大鼠结肠组织中上述三种基因表达的影响,以初步了解严重烫伤后肠道ICC功能上的变化,及其与胃肠道动力障碍之间可能的联系。
方法:56只健康成年Sprague-Dawley大鼠随机分为2组,烫伤补液组48只(以下简称烫伤组)、正常对照组8只。各组大鼠分笼饲养1周,实验开始前禁食12h,自由饮水。烫伤组大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后,背部剃毛并浸入97℃以上热水中15s,造成7cm×4cm的Ⅲ度烫伤创面(方法参照《烧伤治疗学》)。伤后即给予乳酸钠林格液腹腔注射行液体复苏(50ml/kg);对照组未做特殊处理。烫伤组大鼠分别于伤后3h、6h、9h、16h、24h、48h(正常对照组于禁食12h后)无痛断颈处死。立即剪取上段结肠组织各约100mg,装入EP管置液氮生物容器保存;大鼠处死前30min并行碳素墨水灌胃(1ml/只)。处死后即快速小心分离出胃至结肠上段全长,无张力状态下平铺于桌面白纸上,直尺测量其墨水推进最远端距离幽门的长度,并用以表示大鼠肠道推进速率。所获大鼠结肠样本经低温下研磨,TRIzol R、氯仿等提取总RNA,并由逆转录过程获得相应cDNA后,部分转移至含有Kit、Kitl等基因的相应引物及dNTP、SYBR R GREEN Ⅰ试剂的新反应体系,行多聚酶链反应—实时荧光定量PCR(Real Time quantitaftve PCR)。最后将部分PCR反应扩增产物转入琼脂糖凝胶,电泳、鉴定。
结果:
①肠道推进速率:伤后3h、6h、9h、16h、24h、48h烫伤组均明显低于正常对照组水平,差异学意义(p<0.05)。
②2-△△Ct值(荧光定量PCR):伤后3h、6h、9h、16h、24h、48h,烫伤组Gja1、Kit1对应的2-△△Ct值明显低于对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。烫伤组Kit 2-△△Ct值则于伤后6h、9h、16h、24h、48h明显低于对照组,差异有统计学意义(p<0.05);伤后3h虽有降低,但与对照组间差异不显著(p>0.05)。
结论:烫伤后3h、6h、9h、16h、24h、48h,在大鼠胃肠道运动功能明显抑制的同时,结肠组织中编码胞间缝隙连接蛋白的Gial基因以及干细胞因子SCF的编码基因Kit1表达明显减弱;而与Cajal间质细胞功能密切相关的c-kit蛋白编码基因Kit表达则于伤后6h、9h、16h、24h、48h明显低于对照组;三者的水平在伤后48h后均有不同程度回升,但与对照组比较仍有显著的统计学差异(p<0.05)。上述指标的变化大体与大鼠胃肠道运动速率的变化趋势一致。鉴于Caja1间质细胞产生并传导了绝大多数胃肠运动发生所必需的起搏电流,而Kit、Kit1、Gja1编码的蛋白对于维持其起搏电位的产生、传导以及频率的正常至关重要,上述三种基因表达的改变(下降)会对机体的胃肠运动功能产生较明显的影响。本次实验中测得烫伤大鼠结肠组织中三种基因表达水平变化的幅度、时相等特征与肠道推进速率的变化趋势基本一致。推测肠组织细胞中Kit、Kit1与Gja1基因表达的下调及其后可能出现的相应蛋白转录、翻译减少或异常,均可能对肠道Cajal间质细胞的电起搏、传导功能造成损害,从而参与了烫伤大鼠胃肠运动功能障碍的发生、发展过程。