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研究背景:甲状腺癌是最常见的恶性肿瘤之一。在近25年中发病率约增加2倍,目前在临床恶性肿瘤中占1%。甲状腺癌的常见病理类型主要分为以下四种:乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌。甲状腺癌发病率的显著增加,在很大程度上是由于甲状腺乳头状癌的增加所导致的。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是最常见的甲状腺癌类型,占80%-85%。目前PTC的主要治疗方式包括甲状腺切除术（包括颈部淋巴结清扫）、放射性碘（RAI）治疗和TSH抑制治疗。虽然PTC的总体预后较好,但是仍有部分病例复发风险大,降低了患者的生活质量。除此之外,淋巴结转移在PTC患者中非常普遍,大概有80%的病例伴有颈部淋巴结的转移。据最近的文献报道,PTC患者的淋巴结转移与局部复发和生存率有着密切关联。目前,PTC发病和进展的机制尚不完全清楚,进一步探讨与其发生发展及恶性生物学特征相关的因素,揭示其潜在分子机制,为寻找治疗和改善预后的新靶点提供新的方向,也对进一步提高PTC的整体治疗水平,提高患者生活质量具有重要意义。MicroRNA（miRNA）是一类短链非编码的小分子RNA,长度为18～25nt。广泛存在于真核生物中。成熟体microRNA被核糖体识别并整合入RNA诱导的基因沉默复合体（RNA induced silencing complex,RISC）,其功能主要通过特异性识别特定mRNA 3’UTR,与结合位点序列的完全或不完全互补,诱导mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而起到抑制蛋白质合成的作用。近年来,随着有关microRNA越来越多的研究和报道,miRNA被发现在肿瘤发生、恶性进展以及放化疗耐药和抵抗中发挥着不可或缺的作用。Zhang等人的研究表明,在膀胱癌细胞内上调miR-145-5p的表达能够明显抑制细胞的生长和运动能力。在甲状腺滤泡癌中,miR-1通过沉默其靶基因CCND2的表达抑制甲状腺滤泡癌细胞的进展。除此之外,在肺癌、乳腺癌、上颌窦鳞状细胞癌、胆囊癌等多种恶性肿瘤中发现microRNA发挥着抑癌或促癌作用。miR-613是近几年新发现的一个微小RNA,只有一个5’端成熟体,miRNA近年来被发现在多种恶性肿瘤中表达异常,并且在体内或体外改变miR-613的表达,可以调控肿瘤的生长,然而,miR-613在甲状腺乳头状癌发生中的作用机制尚不明确。研究方法:1、收集107例甲状腺乳头状癌患者的癌组织和配对的癌旁正常甲状腺组织。应用实时定量PCR（RT-PCR,real-time quantitative polymerase chain reaction）检测组织中miR-613的表达情况,并分析miR-613表达水平与PTC患者淋巴结转移、多灶性等临床病理特征之间的关系。2、培养三株甲状腺乳头状癌细胞系（K1,TPC-1,BCPAP）和甲状腺正常滤泡上皮细胞系（Nthy-ori-3-1,N3）,RT-PCR检测细胞内miR-613的表达情况,比较PTC细胞系和滤泡上皮细胞系内miR-613表达的差异。3、在PTC细胞系内转染miR-613 mimics以过表达miR-613,RT-PCR检测miR-613的表达水平以评估转染效率并确定最佳转染浓度。实验分组如下:control组（未转染组）、NC组（negative control组）和mimics组（过表达miR-613组）,然后分别通过MTS、伤痕愈合实验和Matrigel基质胶侵袭实验检测在PTC细胞内过表达miR-613对细胞生长、迁移以及侵袭能力的影响;4、在PTC细胞系内过表达miR-613,western blotting检测细胞内上皮细胞间质化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）标志物E-钙黏蛋白（Ecadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和基质金属蛋白酶2（MMP2）的表达,比较各组间上述蛋白表达的差异。5、Targetscan,miRDB,RNAInter和miRWalk数据库预测miR-613下游靶基因,取四个数据库交集以确定下游靶标。双荧光素酶报告实验验证靶基因TAGLN2 mRNA 3’UTR（3’untranslated region）和miR-613的结合;RT-PCR和western blotting分别检测甲状腺乳头状癌组织和配对的癌旁正常组织中TAGLN2 mRNA和蛋白的表达水平,以及在PTC细胞系内过表达miR-613后,细胞内TAGLN2 mRNA和蛋白的表达水平;6、功能回复实验分组如下:control组（未转染组）、mimics组（过表达miR-613组）和mimics+TA组（共转染miR-613 mimics和TAGLN2过表达质粒组）。分别通过MTS、伤痕愈合实验和Matrigel基质胶侵袭实验检测在PTC细胞生长、迁移以及侵袭能力的变化;Western bloting检测EMT标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和基质金属蛋白酶2（MMP2）的表达水平,比较各组间蛋白表达的差异。7、分别在PTC细胞系内过表达和敲减TAGLN2,实验分组如下:control组（未转染组）、p CMVTAGLN2（过表达TAGLN2组）、p CMV-control组（过表达空载体组）、sh-TAGLN2组（敲减TAGLN2组）和sh-control组（敲减空载体组）。Western blotting检测各组PTC细胞内PI3K/AKT通路蛋白（PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT）的表达水平,比较各组间蛋白表达差异。结果:1、RT-PCR结果显示,在癌组织中miR-613相对表达量为1.339±0.523,明显低于miR-613在癌旁正常组织中的表达（3.756±0.934,p<0.01）;并且miR-613的异常表达与PTC颈部淋巴转移密切相关（p<0.01）,而与患者的年龄、性别、肿瘤大小、包膜侵犯以及多灶性无关（p>0.05）。2、与甲状腺正常滤泡上皮细胞N3相比,miR-613在三株甲状腺乳头状癌细胞系K1,TPC-1和BCPAP中的表达水平均明显降低（p<0.05）。miR-613在以上四株细胞系中的表达分别为1.074±0.291,0.195±0.043,0.201±0.053,0.270±0.052。3、与未转染组（control）和阴性对照组（negative control）相比,过表达组（miR-613 mimics）中miR-613的表达水平明显升高（p<0.01）,而未转染组和阴性对照组之间无明显差异（p>0.05）。MTS检测结果显示:与未转染组和阴性对照组细胞增殖能力相比,K1、TPC-1和BCPAP细胞过表达组的细胞增殖能力明显被抑制（p>0.05）。划痕愈合实验检测结果显示:对划痕愈合面积进行测量,K1细胞未感染组、阴性对照组和过表达组平均划痕愈合面积百分比分别为68.6%±1.40%,74.7%±1.80%,52.6%±3.20%;TPC-1细胞为40.7%±2.30%,28.1%±1.60%,38.4%±1.50%;BCPAP细胞为38.6%±3.60%,37.2%±2.80%,28.0%±1.90%,过表达miR-613后细胞的迁移能力明显减弱（p<0.05）。Transwell检测过表达miR-613对PTC细胞侵袭能力的影响:K1细胞未感染组、阴性对照组和过表达组平均细胞数为225.8±14.3,157.3±25.7,268.0±22.5;TPC-1细胞为496.20±73.5,220.2±5.4,498.2±73.7;BCPAP细胞为568.6±25.6,233.8±24.2,532.0±34.1,在PTC细胞内过表达miR-613能够显著抑制其侵袭能力（p<0.05）。4、Western blotting用于检测过表达miR-613后,E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和基质金属蛋白酶2的表达水平的变化。结果显示:在K1细胞中,miR-613过表达组E-钙黏蛋白相对表达量（4.433±0.082）明显高于未转染组（1±0.119,p<0.001）和阴性对照组（1.317±0.037,p<0.001）;N-钙黏蛋白相对表达量（0.218±0.004）明显低于未转染组（1±0.121,p<0.01）和阴性对照组（0.903±0.011,p<0.001）;波形蛋白相对表达量（0.501±0.008）明显低于未转染组（1±0.064,p<0.01）和阴性对照组（1.013±0.012,p<0.001）;金属基质蛋白酶2相对表达量（0.545±0.014）明显低于未转染组（1±0.092,p<0.01）和阴性对照组（0.840±0.016,p<0.001）。在TPC-1细胞中,未感染组、阴性对照组和过表达组中E-钙黏蛋白的相对表达量分别为1±0.018,1.074±0.030,1.959±0.021,过表达组的表达量明显高于未转染组（p<0.001）和阴性对照组（p<0.001）;未感染组、阴性对照组和过表达组中N-钙黏蛋白的相对表达量分别为1±0.230（p<0.05）,0.942±0.015（p<0.001）,0.395±0.035;波形蛋白的相对表达量分别为1±0.058（p<0.01）,1.128±0.030（p<0.001）,0.581±0.021;金属基质蛋白酶2的相对表达量分别为1±0.016（p<0.0001）,0.898±0.047（p<0.001）,0.240±0.009,这三种蛋白在过表达组中均明显降低。BCPAP细胞miR-613过表达组E-钙黏蛋白的相对表达水平为1.460±0.014,高于未转染组1.033±0.141（p<0.05）和阴性对照组1.299±0.015（p<0.01）;过表达组N-钙黏蛋白、波形蛋白和金属基质蛋白酶2的相对表达量分别为0.474±0.034,0.544±0.019和0.267±0.009,明显低于未转染组（1±0.017,p<0.01;1±0.007,p<0.0001;1±0.017,p<0.0001）和阴性对照组（0.887±0.039,p<0.01;0.986±0.016,p<0.0001;1.078±0.037,p<0.0001）。而未转染组和阴性对照组之间无显著差异（p>0.05）。5、Targetscan、miRDB、RNAInter和miRWalk四个在线数据库预测肌动蛋白结合蛋白TAGLN2可能是miR-613直接下游靶基因。双荧光素酶报告实验结果显示,共转染野生型WT质粒+mimics组的荧光比值（1.768±0.085）明显低于共转染野生型WT质粒+NC组的荧光比值（2.324±0.043,p<0.05）。同时,共转染突变型MUT质粒+mimics组的荧光比值（2.819±0.102）与共转染突变型MUT质粒+NC组的荧光比值（2.761±0.172,p>0.05）之间差异无统计学意义,证实TAGLN2 mRNA 3’UTR能够与miR-613直接结合。Western blotting及RTPCR结果显示甲状腺乳头状癌组织中TAGLN2 mRNA及蛋白相对表达量分别为1.831±0.197和1.237±0.145,明显高于癌旁组织（0.973±0.080,p<0.001和0.836±0.145,p<0.01）。同时,在PTC细胞中,通过mimics过表达miR-613,结果显示miR-613抑制细胞内TAGLN2 mRNA和蛋白的表达。6、过表达miR-613的PTC细胞,其恶性生物学行为（增殖、迁移和侵袭）被明显抑制,而共过表达miR-613和TAGLN2的细胞的恶性生物学行为被回复;同时细胞内EMT相关标志物蛋白的表达水平也发生了改变:重新过表达TAGLN2后,细胞内E-钙黏蛋白表达降低,而N-钙黏蛋白、波形蛋白和金属基质蛋白酶2的表达均增高。7、在上调TAGLN2的表达能够增加PTC细胞内p-PI3K和p-AKT蛋白的表达;同时,下调TAGLN2的表达能够降低PTC细胞内p-PI3K和p-AKT蛋白的表达。而无论上调还是下调TAGLN2的表达,PI3K和AKT蛋白的表达水平无明显变化。结论:1、在甲状腺乳头状癌中,miR-613在癌组织中的表达明显低于其配对的癌旁正常组织,并且其表达水平与PTC的颈部淋巴结转移有关,说明miR-613可能在甲状腺乳头状癌细胞的侵袭调控中发挥一定的作用。2、miR-613能够明显抑制PTC细胞增殖、迁移及侵袭能力,以及抑制上皮细胞间质化。过表达miR-613在改善PTC恶性表型方面发挥着重要的作用。3、miR-613参与调节肌动蛋白结合蛋白TAGLN2的表达,在细胞内过表达TAGLN2可以抵消miR-613对PTC细胞的抑制作用,可能是miR-613在甲状腺乳头状癌中发挥抑癌作用的生物学机制。4、TAGLN2可以激活PI3K/AKT信号通路,提示我们TAGLN2可能通过激活PI3K/AKT促进EMT的进展。本研究结果可能为甲状腺乳头状癌的治疗提供新的靶点。