研究目的:角质形成细胞来源于外胚层,是表皮的主要细胞类型。小鼠是当前用于研究人类疾病最重要的模式生物,通过基因编辑技术,小鼠角质细胞正被广泛用于研究表皮屏障、瘢痕形成、银屑病等生理病理机制,具有广阔的应用前景。然而,目前文献中小鼠角质细胞的分离、培养方法各不相同,在体外传代过程中也很容易发生分化和衰老,亦存在贴壁困难、成纤维细胞污染等问题,大大影响了小鼠角质细胞的临床应用。因此,本研究拟对小鼠角质细胞原代分离、培养过程进行条件优化,筛选出最优的分离、培养条件。研究方法:首先比较将小鼠角质细胞从表皮中分离的过程中不同浓度胰酶（0.05%、0.25%）的作用时间、作用温度对角质细胞存活率的影响,并镜下观察后续培养过程中各组角质细胞的生长情况。其次,在细胞培养过程中,通过镜下细胞形态观察、q RT-PCR、CCK8实验比较Epi Life、DK-SFM、Cn T-07三种不同培养基,培养基中添加不同浓度、不同种类血清以及i Matrix 511、Coating Matrix、Attachment Factor三种铺板胶对角质细胞生长、增殖的影响。结果:1.根据台盼蓝染色计数得到小鼠表皮在不同消化条件下得到的角质细胞数量以及活细胞比率,结果表明0.05%浓度的Trypsin-EDTA在常温下消化表皮约20分钟后得到的细胞数量以及存活率略微高于0.05%和0.25%Trypsin-EDTA在37℃条件下消化约9分钟得到的细胞。2.EpiLife培养基中的小鼠角质细胞在形态和生长速率方面优于DK-SFM和Cn T-07培养基。qRT-PCR结果显示小鼠角质细胞在Epi Life培养基条件下角质细胞干性基因（Krt5、Krt14、Krt15）表达最高,成纤维细胞标记基因（Fgf7、Fbn1）表达最低,提示较高的角质细胞干性以及较少的成纤维细胞污染。CCK8结果显示Epi Life培养基条件下的小鼠角质细胞增殖能力和细胞数量均优于DK-SFM和Cn T-07培养基条件下的细胞。根据镜下细胞形态学观察、q RT-PCR检测角质细胞干性基因（Krt5、Krt14、Krt15）、分化基因（Krt1、Krt10）以及成纤维细胞标记基因（Fgf7、Fbn1）的表达以及CCK8检测细胞增殖、数量的结果,在培养基中加入FBS（Fetal Calf Serum）有助于小鼠角质细胞贴壁和增殖,而四季青血清在促进小鼠角质细胞增殖方面的表现最为优秀,GibcoTMFBS次之,KSR（Knockout Serum Replacement）最弱且有明显的促细胞凋亡现象。3.接种在iMatrix 511上的小鼠角质细胞贴壁率、生长速率均高于接种在Coating Matrix、Attachment Factor上的细胞。qRT-PCR结果显示i Matrix 511组小鼠角质细胞干性基因（Krt5、Krt14、Krt15）的表达水平高于Coating Matrix和Attachment Factor组,而成纤维细胞标记基因（Fgf7、Fbn1）表达水平相对较低,同样提示较高的角质细胞干性以及较少的成纤维细胞污染。CCK8结果提示i Matrix 511组小鼠角质细胞初始贴壁数量、增殖能力均优于Coating Matrix和Attachment Factor组。结论:使用较低浓度的胰酶在常温下消化表皮组织足以获得数量多、质量佳的小鼠角质细胞。Epi Life培养基对小鼠角质细胞的生长具有强大的促进作用,在其中添加一定浓度的四季青血清能进一步促进细胞的贴壁和增殖。对培养皿进行i Matrix 511铺胶处理后,角质细胞贴壁率提高、增殖更为迅速。总之,本研究建立了一个优化的小鼠角质细胞原代分离、培养体系,为今后建立更为完善的角质细胞培养方案,解决小鼠角质细胞传代困难的问题,进而服务于各类基础和临床研究提供参考。