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[目的]结直肠癌是三大常见恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均较高。结肠镜检查是目前监测结直肠癌的常用方法,但因其为一种有创性、侵入性检查,且结肠镜检查难以发现微小的平坦病变,故其在监测结直肠癌中的作用尚存在局限性,急需一种无创性生物标志物的发现。MicroRNAs在结直肠癌肿瘤组织和癌旁正常组织中存在差异性表达,且在肿瘤的发生发展中起着重要调控作用。本研究前期通过对结直肠癌肿瘤组织和癌旁正常组织中进行高通量基因芯片分析发现,在结直肠癌肿瘤组织中miR-7-5p的表达量显著下调,但是其在结直肠癌中的具体作用机制仍不清楚。为进一步确认芯片结果,本研究将在10例结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织中检测miR-7-5p的表达情况,通过调节miR-7-5p在结肠癌细胞系CaCo2的表达来观察其对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其内在机制。[方法](1)收集2018年1月至2018年10月在昆明医科大学第一附属医院消化内镜中心行肠镜检查病理诊断为结直肠癌的患者结直肠癌组织标本和距离肿瘤组织10cm以上的正常肠粘膜组织10组。纳入研究的患者均已在知情同意书上签字,未有肿瘤史及手术史,未有放化疗及其他免疫生物治疗史。收集患者年龄、性别、肿瘤位置、分化程度、浸润深度、组织类型等临床病理资料。利用RT-PCR技术比较和分析结直肠癌组织与癌旁正常组织中miR-7-5p表达的差异性,并分析其与临床病理资料之间的关系。(2)通过生物信息学数据库TargetScan、miRPathDB、miRDB、miRWalk 对 miR-7-5p 的靶基因进行预测,选择预测值较高且交集高的靶基因作为miR-7-5p的靶点,利用Western blot技术检测结直肠癌组织和对应癌旁正常组织中miR-7-5p靶基因的表达情况,将miR-7-5p inhibitor、miR-7-5p mimic 转染至 CaCo2 细胞株,利用 Western blot 技术对二者的靶向关系进行验证。(3)将miR-7-5p mimic转染至CaCo2细胞株,利用CCK-8法检测过表达miR-7-5p后细胞的增殖情况,利用TUNEL法联合流式细胞术检测过表达miR-7-5p后细胞的凋亡情况,利用RT-PCR技术检测增殖凋亡相关分子(Bax、Bcl-2、Caspase-3、MMP2)的 mRNA 水平。[结果](1)RT-PCR技术实验结果显示:与癌旁正常组织(1.000±0.014)相比,miR-7-5p在结直肠癌组织中(0.409±0.095)低表达,差异有统计学意义(P<0.01);miR-7-5p在结直肠癌患者组织中的表达水平与患者年龄(t=1.06,p=0.694)、性别(t=1.345,p=0.068)、肿瘤位置(t=4.142,p=0.757)、浸润深度(t=0.698,p=0.318)、分化程度(t=-0.592,p=0.757)、淋巴转移(t=0.081,p=0.072)均无关。(2)通过生物信息学数据库TargetScan、miRPathDB、miRDB、miRWalk对miR-7-5p的靶基因进行预测,选择预测值较高且交集高的靶基因肠三叶因子(Trefoil factor3,TFF3)作为 miR-7-5p 的靶点,Western blot 结果显示,与癌旁正常组织(1.000±0.020)相比,TFF3在结直肠癌组织(1.575±0.012)中高表达,差异有统计学意义(P<0.01);且Western blot结果显示TFF3蛋白表达量与miR-7-5p表达水平呈负相关。在结肠癌细胞CaCo2中过表达miR-7-5p后,过表达miR-7-5p对照组(0.729±0.041)与空白组(正常培养的结肠癌CaCo2细胞)(1.000±0.066)、空白对照组(结肠癌细胞转染mimic control)(0.847±0.042)相比,可以抑制TFF3的表达,差异有统计学意义(P<0.001);在结肠癌细胞CaCo2中抑制miR-7-5p后,空白组(正常培养的结肠癌CaCo2细胞)(1.000±0.022)、空白对照组(结肠癌细胞转染inhibitor control)(0.984±0.066)与转染miR-7-5p inhibitor 对照组(1.000±0.041)相比,miR-7-5p inhibitor 对照组能够显著提高 TFF3蛋白水平,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)将miR-7-5p mimic转染至CaCo2细胞株后,通过RT-PCR验证转染miR-7-5p对照组(914.490±86.630)与相应的空白组(正常培养的结肠癌CaCo2细胞)(1.000±0.200)、空白对照组(结肠癌细胞转染mimic control)(1.720±0.060)相比其可成功过表达miR-7-5p(P<0.01);CCK8细胞活力检测发现,空白组对细胞活力基本无影响(1±0.007),而过表达miR-7-5p对照组(0.930±0.007)相比空白对照组(0.990±0.005)能够显著降低细胞的相对存活率(P<0.001);显微镜下观察发现与空白组、空白对照组相比,过表达miR-7-5p对照组能够显著降低细胞数量;流式检测miR-7-5p过表达对CaCo2细胞凋亡的影响发现,过表达miR-7-5p对照组能够显著增加早期凋亡细胞(50.700±0.989)和晚期凋亡细胞(40.525±0.515)的比例,降低活细胞(0.455±0.422)的比例,对死细胞(1.295±0.074)的影响较小;荧光检测miR-7-5p过表达对CaCo2细胞凋亡的影响发现,在结肠癌细胞CaCo2中过表达miR-7-5p后,转染mimic control对细胞凋亡没有影响,而过表达miR-7-5p能够显著增加Annexin V-FITC(绿色荧光)和碘化丙啶(红色荧光);RT-PCR检测发现,在结肠癌细胞CaCo2中过表达miR-7-5p能够显著提高Bax、Bcl-2、Caspase-3、MMP2的mRNA表达水平。[结论](1)miR-7-5p在结直肠癌组织中低表达,且其在结直肠癌中的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤位置、浸润深度、分化程度、淋巴转移等均不相关。(2)miR-7-5p可通过靶向TFF3基因参与调控结直肠癌的发生发展。(3)miR-7-5p可通过抑制其靶基因TFF3抑制结直肠癌的增殖、促进细胞凋亡,从而发挥其抑癌效应。