1.研究背景和目的在全球范围,宫颈癌每年新发病例50万,死亡约20万人；在我国每年新发病例超过13万(占全球四分之一),死亡约20万人,死亡率居妇科恶性肿瘤的首位。研究已经明确,宫颈癌的主要致病原因是人乳头瘤病毒((Humanpapilloma virus, HPV)感染。其中宫颈腺癌占10-34%,虽然所占比例较少,但是近年来呈上升及年轻化趋势。宫颈腺癌起源于宫颈管内膜,常向内浸润生长,缺乏明显临床症状,转移出现较早,预后较差,以手术、放疗、化疗为主的综合治疗难以取得满意的疗效。顺铂被认为是宫颈癌最有效的化疗药物,被举荐用于复发或远处转移宫颈癌的一线化疗,但肿瘤细胞容易对其产生耐药性,导致化疗无效。基于宫颈腺癌生物学及治疗的反应异于宫颈鳞癌,因此,寻求新的宫颈腺癌治疗方法和药物显得非常重要。肿瘤分子靶向治疗是一种全新的生物治疗模式,在肿瘤靶向治疗中其特异性最高。其针对细胞癌变、促进肿瘤细胞增殖和转移的环节,从分子水平阻断肿瘤恶性生物学行为,从而抑制肿瘤细胞生长和转移,甚至使肿瘤消退。近年来随着肿瘤分子靶向治疗地快速发展,分子靶向治疗药物层出不穷,为复发的转移的卵巢癌治疗展现了广阔的治疗前景。目前宫颈癌的靶向治疗药物研究主要有以下几类：①表皮生长因子受体抑制剂：一是EGFR单克隆抗体,二是小分子酪氨酸激酶抑制剂；②抗血管生成抑制剂；③多靶点酶抑制剂；④mTOR通路抑制剂。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR),是一种跨膜糖蛋白。表皮生长因子受体(EGFR/HER)家族由四个糖蛋白组成,包括ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER-2)、ErbB3(HER-3)、ErbB4(HER-4)。EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物,是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR主要的信号通路有3条：①有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)途径。②磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)途径。③c-Src途径。通过以上3条主要途径,发挥调节细胞的增殖、存活、粘附、迁移和分化的功能。EGFR稳定表达于多种上皮组织、间质和神经源性组织。研究表明,其在宫颈癌等上皮源性肿瘤中高表达,并与肿瘤进展、血管生成、转移扩散、凋亡受抑、放化疗抵抗密切相关。EGFR已成为肿瘤治疗的重要靶点。EGFR抑制剂主要有两类：一是EGFR单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb);二是小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinaseinhibitor, TKI)。2.尼妥珠单抗抗肿瘤研究2.1尼妥珠单抗抗肿瘤机制尼妥珠单抗是我国第一个以EGFR为靶点的人源化单克隆抗体。尼妥珠单抗可以与EGFR特异性结合,并通过占据EGFR分子的3A表位,竞争性抑制EGFR的天然配体EGF等与EGFR的结合,有效阻断经EGFR介导的信号传递和细胞反应,进而抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞的凋亡和抑制新生血管的生成。2.2尼妥珠单抗临床前研究尼妥珠单抗联合伊立替康、氟尿嘧啶治疗高表达EGFR的结肠癌细胞株LoVo,结果显示尼妥株单抗可增强伊立替康、氟尿嘧啶的体外抑制作用,促进细胞死亡,表明尼妥珠单抗可以增强化疗的抗肿瘤效应。尼妥珠单抗在非小细胞肺癌细胞株中的作用发现,与EGFR表达水平有关,而与是否存在EGFR突变无关。尼妥珠单抗对外阴鳞状细胞癌A431细胞的体内外实验均显示抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡、抑制VEGF介导的血管形成的作用,从而达到增强放疗敏感性的。以上研究证明尼妥珠单抗在体内外均有增强放化疗的抗肿瘤作用。2.3尼妥珠单抗临床研究尼妥珠单抗目前正在进行结直肠癌、胰腺癌、肝癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等临床研究,初步结果显示尼妥珠单抗对多种肿瘤具有一定疗效,值得进一步研究。2004年被批准用于脑胶质瘤,2009年批准用于头颈部肿瘤。2.3.1尼妥珠单抗在脑胶质瘤的临床研究2009年汪洋等针对脑胶质瘤的初步研究。试验方法为：本试验采用前瞻性研究,共17例患者,其中12例患者为新诊断的高分级脑胶质瘤,放疗总剂量为60Gy/30次,3例复发者的放疗总剂量50Gy/25次,2例脑干复发者的放疗总剂量为40Gy/20次；放疗期间每天口服替莫唑胺50mg/m2,放疗结束后休息4周后循环口服替莫唑胺,第一个疗程剂量为150mg/m2,连续口服5天,第二个疗程起每天加量至200mg/m2,28天为1个疗程。放疗期间每周静脉滴注尼妥珠单抗200mg(小于14岁患者用量为100mg)。研究结果：急性不良反应多为Ⅰ-Ⅱ级,没有Ⅲ级不良反应,有1例因发生Ⅱ级湿疹样皮炎,中断尼妥珠单抗治疗,16例患者的近期疗效评价,其中PR4例、SD10例、PD2例。6个月无进展生存率和总生存率分别为72.1%和86.3%。本研究的结论尼妥珠单抗联合放疗加同期替莫唑胺治疗高分级脑胶质瘤反应小,患者可以耐受,近期疗效较好。古巴进行的一项尼妥珠单抗用于脑胶质瘤的研究,成人和儿童尼妥珠单抗使用剂量分别为200mg、100mg,共有99例符合要求入组,58例可行疗效评价,其中28例儿童组疾病控制率为89%(25/28),其中11例CR、4例PR、10例SD,总生存率为78%(22/28)；30例成人组疾病控制率为60%(18/30),其中8例CR、1例PR、9例SD,总生存率为63%(19/30)。仅有轻到中度毒副作用,可以耐受。该药有望成为脑胶质瘤的一线治疗方案。2.3.2尼妥珠单抗在头颈部肿瘤的临床研究Rodriguez MO等进行的一项双盲、随机对照临床研究,评价尼妥珠单抗联合放疗治疗不能手术的晚期头颈鳞癌患者的疗效,共有106例患者入组,分为试验组和对照组,试验组采用尼妥珠单抗联合放疗,对照组采用安慰剂联合放疗。毒副作用表现为Ⅰ-Ⅱ级的乏力、发热、头痛、畏寒,无皮疹,患者可以耐受。结果显示在试验组比对照组表现出较好的缓解率和生存质量的提高。2007年第六届全国放射肿瘤学学术会议关于尼妥珠单抗联合放疗治疗局部晚期鼻咽癌的远期疗效及毒副反应,该试验分为联合治疗组和单纯放疗组,联合治疗组和单纯放疗组的1、2、3、4年局部控制率分别为100%、833%、83.33%、83.33%和100%、85.71%、57.14%、57.14%；两组1、2、3、4年总生存率分别为85.71%、85.71%、71.43%、71.43%和100%、85.71%、85.71%、68.57%,虽然上述数据统计学上无明显差异,但是尼妥珠单抗联合放疗治疗局部晚期鼻咽癌有提高患者远期疗效的趋势,且安全可靠,未观察到远期毒副作用。3.疗效检测指标—双调蛋白3.1双调蛋白正常生理功能及异常病理功能双向调节蛋白(amphiregulin/AREG/AR)是表皮生长因子(EGF)家族中的一员,在不同组织细胞中有不同作用,既具有促进生长作用又有抑制的双重作用,因此称为双调蛋白。双调蛋白的前体是一个有252个氨基酸组成的跨膜蛋白,成熟的分泌型双调蛋白是一种糖蛋白,有84个氨基酸组成的,相对分子量为18-22×103。双调蛋白在各种组织中均有表达,其中主要在泌尿生殖系统诸如乳腺、卵巢、子宫、胎盘、前列腺等,另外在胰腺、循环系统、呼吸道及消化道亦有表达。双调蛋白参与一系列的生理过程,包括乳腺发育、胚胎着床、骨的生成、轴突生长、角质增殖等等。双调蛋白在肿瘤中有不同作用,包括在生长信号刺激下的自给自足作用、凋亡的逃避、无限制的复制能力、持续的血管生成能力、侵袭及转移能力、癌症治疗的抵抗作用。3.2双调蛋白在肿瘤中的作用目前发现双调蛋白在乳腺癌、肺癌、肠癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、胆道癌、皮肤癌、头颈肿瘤、间充质恶性肿瘤、恶性纤维组织瘤、骨髓瘤、血液学恶性肿瘤等等均高表达或者过表达。研究发现双调蛋白在非小细胞肺癌伴脑转移的患者中比原发肿瘤患者表达增加。另外发现结直肠癌原发灶双调蛋白的表达与肝转移存在相关性,针对肝转移多因素分析证实,双调蛋白的表达可作为结肠癌肝转移预后的独立因素。D’Antonio A等研究发双调蛋白的表达与低分化和低增殖活性的卵巢癌存在显著相关性。在野生型K-ras基因结肠癌患者中,接受西妥昔单抗治疗,检测发现上皮调节蛋白和双调蛋白表达高的患者,有效性更大。EGFR野生型双调蛋白阳性的非小细胞患者可以从酪氨酸激酶抑制剂(易瑞沙、特罗凯)治疗获益,在酪氨酸激酶抑制剂治疗中,血清中高双调蛋白,特定病生存率升高。基于上述资料本研究选择双调蛋白作为尼妥珠单抗体外抑制作用检测指标。本课题通过研究尼妥珠单抗及顺铂联合宫颈腺癌细胞Hela细胞在的体外抑制实验,研究尼妥珠单抗对宫颈腺癌细胞凋亡、细胞周期及双调蛋白的影响,以探讨其可能作用机制,宫颈腺癌的综合治疗、个体化治疗提供理论基础。第一章尼妥珠单抗联合顺铂对宫颈腺癌Hela细胞体外生长的抑制作用及对细胞周期及凋亡的影响一、材料和方法1.Hela细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养,3-5天传一次代,选择对数生长期细胞作为实验用；2.用MTT法检测Hela细胞生长曲线：设置正常组和空白对照组,细胞种板过夜后检测OD值(490nm),连续7天在同一时间检测,并用SPSS绘制细胞生长曲线；3.宫颈癌Hela细胞EGFR的表达：待细胞长满培养瓶80%后收集细胞,用Trizol法提取细胞总RNA,逆转录成cDNA后采用RT-PCR检测EGFR基因表达情况。4将细胞分成4组,分别为尼妥珠单抗单药组、顺铂单药组、尼妥珠单抗联合顺铂组、空白对照组。检测细胞增殖抑制率时尼妥珠单抗药物浓度分别为12.5、25、50、75、100ug/ml; DDP药物浓度分别0.75、1.5、3、6、12ug/ml,分别于加药后24h、48h、72h检测。尼妥珠单抗联合顺铂组药物浓度是0.75ug/ml+50ug/ml、1.5ug/ml+50ug/ml、3ug/ml+50ug/ml,药物作用72h后检测。流式细胞仪检测细胞周期及凋亡时,尼妥珠单抗药物浓度均为25、50、100ug/ml。5.采取上述分组,用MTT法检测药物对人宫颈癌Hela细胞增殖的抑制,根据OD值计算细胞生长抑制率。6.采用协同作用q值判断尼妥珠单抗和顺铂联用的性质,q=EAB/EA+EB-EAxEB, EAB是两药联合的抑制率,EA、EB分别是药物单药抑制率。q>1.15为协同作用,0.85≤q≤1.15为相加作用,q<0.85为拮抗作用。7.采取上述分组,收集细胞用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡8.统计处理：实验结果以均数±标准差(x±s)表示,数据处理采用SPSS13统计软件,各组间细胞抑制率比较采用析因设计的方差分析；细胞周期及细胞凋亡率结果采用单因素方差分析(one-way ANOVA);多重比较采用LSD检验或Dunnett’s T3检验。P≤0.05(双侧)表示有统计学差异。二、结果1.宫颈癌Hela细胞生长曲线：从生长曲线观察,种板后的Hela细胞第1-7天均呈指数生长,其中第4-7天生长最快,之后开始逐渐减慢。2.宫颈癌Hela细胞EGFR的表达：通过RT-PCR的定性检测,证明Hela细胞存在EGFR表达。3.尼妥珠单抗联合DDP对人宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用经MTT法检测,不同浓度、不同时间尼妥珠单抗或顺铂单药对人宫颈腺癌细胞Hela均有抑制作用,并随着浓度的增高及时间的延长其抑制率显著增高(P均<0.05)。尼妥珠单抗联合顺铂(50ug/ml+0.75ug/ml、50ug/ml+1.5ug/ml、50ug/ml+3ug/ml),药物联合呈相加作用。4.尼妥珠单抗单药对人宫颈癌Hela细胞周期的影响对照组和25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml组的G0/G1期、S期、G2/M期比率间有显著差异(P均<0.05)。G0/G1期随着浓度的增高其比率呈上升趋势,而G2/M期、S期则相反,呈下降趋势。5.尼妥珠单抗对人宫颈癌Hela细胞凋亡的影响尼妥珠单抗能够显著诱导Hela细胞凋亡,且随给药剂量的增加,凋亡率增高,较对照组均有统计学差异(P<0.05)。第二章尼妥株单抗对宫颈腺癌Hela细胞双调蛋白表达的影响一、材料和方法1.Hela细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养,3-5天传一次代,选择对数生长期细胞作为实验用；2.实验分为对照组,尼妥珠单抗单药组(25ug/ml、50ug/ml、75ug/ml),加药培养72h后提取RNA,逆转录,RT-PCR检测Hela细胞双调蛋白基因的表达变化。3.统计方法：所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计处理。实验数据以均数±标准差(x±s)表示,数据统计采用单因素方差分析(one-way ANOVA);多重比较均采用LSD检验。取P<0.05(双侧)表示差异有统计学意义。二、结果与对照组相比,尼妥珠单抗单药组(25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml)双调蛋白基因表达量显著上调(P<0.05),且随着药物浓度的升高,双调蛋白基因表达上升。三、结论EGFR基因在宫颈癌Hela细胞中表达,可以作为宫颈癌治疗靶点。尼妥珠单抗单药、顺铂单药对宫颈癌Hela细胞均有抑制增殖作用,呈剂量和时间依赖性；两药联合表现为相加作用。尼妥珠单抗单药作用Hela细胞后,细胞周期分析显示G0/G1期细胞较对照组显著增多,S、G2/M期细胞则较对照组显著减少。尼妥珠单抗能够诱导Hela细胞凋亡,并随给药剂量的增加,凋亡率显著增高。尼妥珠单抗作用Hela细胞后,双调基因表达上调,提示尼妥珠单抗有望成为治疗和预测的靶点,值得进一步深入研究。