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蚯蚓(Eisemia Foetida)又名地龙、曲蟮等,属环节动物门,寡毛纲,无脊椎陆生动物。全世界已知的蚯蚓种类有3000多种,分为水栖类、陆栖类以及少数寄生类,可供养殖的陆栖蚯蚓种类只有十几种。我国蚯蚓资源丰富,有13个品种,作为药用已有数千年的历史,药用蚯蚓是主产于广东、广西等地,经剖腹洗净的干燥体,土蚯蚓则是主产于河南、江苏、山东、安徽等地的去内脏、泥沙的干燥体。蚯蚓具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功效,现代研究发现蚯蚓还有抗血栓、调节免疫、降压、抗心律失常、镇痛消炎等作用。最近几年蚯蚓的抗肿瘤活性引起国内外学者的重视,成为目前研究的热点。以蚯蚓蛋白为主要成分的抗结肠癌作用的研究较少,有限的关于蚯蚓抗肿瘤的资料也很少对相关机理进行全面探索。本课题选用山东大学威海国际生物技术研发中心从赤子爱胜蚓干体中分离获得的的蛋白,在前期研究的基础之上探讨蚯蚓活性蛋白诱导DLD-1细胞死亡的作用及其及可能的作用机制,并初步研究了蚯蚓活性蛋白对DLD-1细胞迁移的作用。论文的主要内容及结果如下：1蚯蚓干体中活性蛋白的分离提取。先将蚯蚓干体在磷酸盐缓冲液中浸泡,然后在进行匀浆、离心、盐析、透析、冷冻干燥等多步操作,干燥器内保存备用。研究中先后制备了6批样品,收率稳定。2蚯蚓活性蛋白对结肠癌DLD-1细胞的作用研究。MTT结果表明蚯蚓活性蛋白可以显著地抑制DLD-1细胞的存活,最佳作用浓度和最佳作用时间分别为400μg/ml和48h。光学显微镜下观察发现,蚯蚓活性蛋白作用后,DLD-1细胞出现形态改变、体积减小、细胞间隙增大,细胞碎片增多,细胞漂浮等现象。Hoechst33342/PI双染结果显示蚯蚓活性蛋白作用48h后,DLD-1细胞部分呈致密浓染或呈碎块状致密浓染,且随着浓度的增大,作用更明显。琼脂糖凝胶电泳分析蚯蚓活性蛋白有促进DLD-1细胞DNA片段化的趋势。初步推测蚯蚓活性蛋白可以诱导DLD-1细胞凋亡。体内实验结果证实蚯蚓活性蛋白可以显著的抑制DLD-1细胞移植瘤的生长。划痕实验初步证实蚯蚓活性蛋白可以抑制DLD-1细胞的迁移。3蚯蚓活性蛋白抗结肠癌DLD-1细胞活性机制的研究。AnnexinV-FITC/PI双染的结果显示,蚯蚓活性蛋白作用48h后DLD-1细胞凋亡率增高。流式细胞仪检测线粒体膜电位,结果表明与空白组相比蚯蚓活性蛋白作用DLD-1细胞48h后,线粒体膜电位降低。细胞周期的检测结果显示蚯蚓活性蛋白可以诱导人结肠癌DLD-1细胞周期阻滞于S期,且呈现一定的量-效关系。Western blot结果表明蚯蚓活性蛋白作用于DLD-1细胞后,与凋亡通路相关的细胞色素C、Caspase-3、Caspase-9,以及p53和下游的靶点蛋白p21表达量明显升高；Bax的表达量升高而Bcl-2的表达量降低。因此我们猜测蚯蚓活性蛋白可以诱导DLD-1细胞发生凋亡,且内质网途径、线粒体途径,以及p53通路均发挥了作用。此外ERK,p-ERK等蛋白的表达量也因蚯蚓活性蛋白的作用发生了改变,但其作用过程仍有待继续研究。蚯蚓干体相对于鲜活体具有储藏、运输方便等优势,本课题从蚯蚓干体中分离提取了具有抗肿瘤活性的蛋白成分,对其抗DLD-1细胞活性及其可能存在的机制进行了相关研究,对蚯蚓主要成分开发成抗肿瘤药物的研究提供了一定的理论依据,扩展了蚯蚓的药用领域,扩大了抗肿瘤药物的研发来源,因此本项研究具有一定的理论和实用价值。