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背景:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)可并发多种血管并发症,如糖尿病肾病、动脉粥样硬化、中风、心衰等,而后者是其致残致死的重要原因。内皮细胞功能紊乱是DM并发动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)发生的早期信号,因此,保护血管内皮细胞功能对治疗及预防糖尿病血管病变具有重要意义。糖基化终末产物(Advanced glycation endproducts,AGEs)的积累与DM多种血管并发症的发生及发展密切相关。研究表明,AGEs可导致多种细胞因子分泌异常及细胞代谢紊乱,进而引起内皮细胞结构改变和功能异常。糖尿病高糖状态下,AGEs生成明显加速,并在血管壁沉积而难以降解,通过与其受体结合后激活氧化应激,诱导活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成明显增加,破坏内皮细胞功能,导致线粒体功能障碍,并促使其凋亡。因此,如何对抗AGEs的血管损伤效应,已成为众多学者关注的问题。p38细胞丝裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信号通路为MAPK家族的重要成员,该通路作用的发挥主要是通过磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)实现的。研究显示,p38 MAPK信号通路的激活与血管损伤和器官微循环的病理生理改变有着密切关联。如AGEs通过p38 MAPK信号通路介导了肾脏微血管内皮的损伤及血流屏障的影响;抑制p38 MAPK活化可减轻高糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激水平,使ROS生成量降低;高糖干预人冠状动脉一段时间后,可通过增强NADPH氧化酶活性,使ROS产生增加,而高糖及ROS均可激活p38 MAPK信号通路,从而诱导细胞损伤。高糖及ROS均可激活p38MAPK磷酸化而促进细胞凋亡已得到共识,但其具体机制尚不明确。文献报道,一定浓度的AGEs可通过p38 MAPK信号通路介导,使内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶(e NOS)表达下调,NO生成减少,从而促进细胞凋亡。胰高血糖素样肽1(Glucagon like Peptide-1,GLP-1)是由肠道内分泌细胞和脑神经细胞分泌的多肽类激素,不仅可通过促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素释放等发挥良好的降糖效果,还具有心血管系统保护作用,是治疗T2DM非常有前景的新药。近年研究显示,除抗炎作用外,GLP-1还可通过c AMP/PKA、PI3K/Akt、NADPH、p38 MAPK等信号途径发挥抗氧化损伤作用,从而对内皮细胞发挥有效保护作用。研究表明,在高糖诱导的内皮细胞损伤中,GLP-1或其类似物Exendin-4可激活PI3K/Akt,提高NO水平从而促内皮细胞增殖;而其下游信号通道p38MAPK-e NOS也在GLP-1保护高糖诱导的内皮细胞损伤中发挥重要作用。但目前相关研究仍甚少。由此可见,在DM各种代谢紊乱的环境中,激活氧化应激是AGEs诱导血管内皮细胞损伤的关键病理因素。GLP-1在降糖的同时,可拮抗AGEs诱导的氧化应激而保护血管内皮细胞。然而,其具体保护机制尚不明了。本研究以AGEs诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为研究模型,探讨p38 MAPK-信号通道在GLP-1干预AGEs诱导内皮细胞损伤中的作用机制,从而为疾病的发生及治疗研究展示广阔的前景。目的:本课题以AGEs诱导的HUVECs损伤为研究模型,通过检测GLP-1对p38MAPK信号通道及其下游e NOS蛋白表达的影响,观察GLP-1或p38 MAPK抑制剂干预对血管内皮细胞ROS生成及细胞凋亡的作用,初步探讨p38 MAPK信号通道在GLP-1干预AGEs诱导血管内皮细胞损伤中的作用机制。方法:1.HUVECs的分离、培养及鉴定根据前期经验获取、分离、培养HUVECs,细胞经v WF抗体免疫荧光染色进行鉴定。取第3-5代细胞用于后续实验。2.体外制备、鉴定AGEs1.6 g牛血清白蛋白(BSA)与3.0 g D-葡萄糖溶于10 m L PBS中,避光孵育12周制备AGEs。荧光分光光度计鉴定AGEs。以同样条件下不含糖的BSA溶液孵育12周后制备的溶液作为本实验的阴性对照组。3.Western blotting法检测p38 MAPK、e NOS磷酸化作用阴性对照组、AGEs组、GLP-1组、AGEs+GLP-1组分别检测p38 MAPK磷酸化蛋白及总p38 MAPK蛋白表达;阴性对照组、AGEs组、AGEs+GLP-1组、AGEs+p38 MAPK抑制剂组、AGEs+GLP-1+p38 MAPK抑制剂组分别检测e NOS磷酸化蛋白及总e NOS蛋白表达。p38 MAPK抑制剂预处理细胞1 h后,加入(或不加)GLP-1 100 n M干预30 min,最后加400 ug/m L AGEs作用24 h(本课题前期研究显示,400 ug/m L AGEs作用24 h后,可显著诱导内皮细胞凋亡;GLP-1采用100 nm浓度下,可显著抑制AGEs诱导的细胞凋亡)。阴性对照组采用与AGEs相同浓度的BSA溶液。(以下部分均按该方法操作,不再赘述。)4.流式细胞仪检测GLP-1及p38 MAPK抑制剂对细胞ROS生成水平及细胞凋亡率的影响。实验分6组:阴性对照组、AGEs组、GLP-1组、AGEs+GLP-1组、AGEs+p38MAPK抑制剂组、AGEs+GLP-1+p38 MAPK抑制剂组。细胞接种于6孔板,随机进行分组处理,DCFH-DA荧光探针检测细胞ROS含量,Annexin V/PI染色法检测细胞凋亡率。5.硝酸还原酶法检测e NOS抑制剂使用前后AGEs及AGEs+GLP-1处理组细胞NO生成水平。6.Annexin V/PI双染色法检测e NOS抑制剂使用前后AGEs及AGEs+GLP-1处理组的细胞凋亡率。统计学处理:数据采用SPSS 17.0进行统计分析,数据以均数±标准差(±s)表示,多组比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA)检验,两两比较采用LSD法。P<0.050为差异有统计学意义。结果:1.GLP-1对AGEs诱导下HUVECs p38 MAPK磷酸化作用的影响方差分析显示,各组间细胞磷酸化p38 MAPK蛋白表达具有显著差异(F=56.989,P=0.000),而总p38 MAPK蛋白表达无变化(F=0.568,P=0.652)。与BSA对照组比较,AGEs可显著活化内皮细胞p38 MAPK蛋白磷酸化(P=0.001),而GLP-1可拮抗该活化作用(P=0.000)。2.p38 MAPK抑制剂(SB203580)对HUVECs e NOS磷酸化作用的影响予以不同处理后,各组间细胞磷酸化e NOS蛋白表达具有显著统计学差异(F=6.645,P=0.007),但总e NOS水平无统计学差异(F=1.677,P=0.231)。与BSA对照相比较,AGEs可显著降低磷酸化e NOS表达水平(P=0.007),GLP-1及SB203580均可拮抗AGEs对磷酸化e NOS的抑制作用(P=0.004)(P=0.011)。3.AGEs诱导下,GLP-1及p38 MAPK抑制剂对HUVECs ROS生成及细胞凋亡的影响与BSA对照组相比,AGEs处理组ROS生成水平及细胞凋亡率显著增高(P=0.000)(P=0.000),GLP-1单独处理并不影响细胞ROS生成量及细胞凋亡率(P=0.170)(P=0.234);而AGEs组加入GLP-1或SB203580后,细胞ROS水平均显著减弱(P=0.000)(P=0.006),细胞凋亡率显著下降(P=0.000)(P=0.000);予以SB203580预处理后,GLP-1对AGEs诱导ROS生成及细胞凋亡的拮抗作用无改变(P=0.828)(P=0.424)。4.AGEs诱导下,GLP-1及e NOS抑制剂(L-NAME)对HUVECs NO生成水平的影响方差分析后多重比较显示,与BSA阴性对照组相比,AGEs可明显降低NO生成水平(P=0.000),而GLP-1单独处理对细胞NO生成的影响无统计学意义(P=0.055);AGEs组加入GLP-1后,细胞NO含量较单纯AGEs处理组显著升高(P=0.000);而在AGEs+GLP-1组予以L-NAME预处理细胞后,细胞NO含量较AGEs+GLP-1组降低(P=0.011)。5.AGEs诱导下,e NOS抑制剂对GLP-1抗细胞凋亡的影响加入GLP-1与AGEs共孵育后,细胞凋亡率较单纯AGEs组显著降低(P=0.000);而在AGEs+GLP-1共孵育组加入L-NAME后,GLP-1的抗凋亡作用显著减弱(P=0.002)。结论:1.AGEs可激活血管内皮细胞p38 MAPK信号通道,而GLP-1可拮抗该作用。2.GLP-1可通过抑制p38 MAPK信号通道的活化,拮抗AGEs诱导的血管内皮细胞氧化应激反应及细胞凋亡。3.GLP-1可通过抑制p38 MAPK信号通道,激活e NOS信号通道,进而拮抗AGEs诱导的内皮细胞NO生成障碍及细胞凋亡。