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[研究背景]近年来,炎症性肠病的影响在我国日益严重。然而该类疾病难以治愈,传统药物治疗效果不佳。炎症性肠病的发生和进展与肠黏膜屏障功能受损密切相关。肠黏膜屏障功能维持依赖于肠上皮细胞之间的紧密连接与肠上皮结构的完整性。之前研究表明,干扰素-γ(IFN-γ)可通过激活肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)增加肠上皮紧密连接通透性,从而破坏肠黏膜屏障功能。但是,目前还不清楚IFN-γ是否能通过调节肠上皮细胞存活、增殖及分化来影响炎症肠病的发生和进展。[研究目的]本研究通过对IFN-γ影响肠上皮细胞存活、增殖及分化调控机理的研究,探索其调节肠黏膜屏障功能的分子机制,揭示IFN-γ与炎症性肠病发生发展之间的关系,并探讨IFN-γ能否作为新靶点用于开发新型炎症性肠病治疗药物。[研究方法]1.为研究IFN-γ调控肠上皮细胞坏死的机制,采用以下研究方法:(1)建立两种实验性结肠炎小鼠模型:1)DSS(硫酸钠葡聚糖,dextran sulfate sodium)诱导的结肠炎小鼠模型;2)T细胞过继转移(T cell adoptive transfer)诱导的结肠炎小鼠模型。在诱导结肠炎的不同时间点收集样本,研究结肠炎发展各个阶段,IFN-γ表达与细胞程序性坏死标记基因表达之间的相关性;(2)体外培养野生型小鼠(Wild-type)的肠类器官,分别用ENR(含EGF,Noggin 和 R-spondin)和 WRN(含 Wnt,R-spondin 和 Noggin)两种培养基培养,通过明视野观察IFN-γ对肠类器官存活的影响;(3)通过相关细胞死亡染色检测肠上皮细胞的存活情况,并通过荧光定量PCR(qPCR)和免疫印迹测定细胞死亡标记基因的表达;(4)采用细胞凋亡和程序性坏死特异性抑制剂对IFN-γ处理的肠类器官进行挽救实验,探究IFN-γ调控细胞死亡的主要方式。同时培养基因型为Ripk3-/-、Mlkl-/-的突变小鼠的肠类器官,通过阻断程序性坏死通路进一步探讨IFN-γ导致肠上皮细胞死亡的方式;(5)通过构建含有鼠源Mlkl基因启动子的pGL3-luciferase表达载体,在Hela细胞中进行体外双报告基因实验,进一步研究IFN-γ增加Mlk1基因表达的机制;(6)采用JAK激酶活性抑制剂,分析阻断JAK/STAT1信号通路对IFN-γ处理的肠类器官的挽救效果;(7)向野生型小鼠腹腔注射过量IFN-γ,通过病理分析,qPCR和免疫印迹技术检测小鼠的肠黏膜损伤及细胞死亡标记基因表达,在体内研究过量IFN-γ对小鼠肠上皮细胞的损伤作用。2.为研究IFN-γ调控肠上皮细胞增殖和分化的机制,采用以下研究方法:(1)用ENR培养基培养野生型小鼠肠类器官,观察分析IFN-γ处理后肠类器官的生长状况。对肠类器官进行EdU染色,同时利用细胞流式技术分析肠细胞的增殖情况。通过qPCR检测肠类器官中增殖相关基因和“过渡-扩增”细胞(TA细胞)标记基因的表达;(2)培养Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2小鼠的肠类器官,利用荧光分析和细胞流式技术检测IFN-γ处理后肠干细胞数量,采用qPCR和免疫印迹检测活跃型和静息型肠干细胞标记基因的表达;(3)采用qPCR和免疫印迹技术检测吸收型肠上皮细胞标记基因的表达;(4)采用免疫荧光染色检测分析IFN-γ处理后肠类器官各种分泌型上皮细胞的数目,同时检测分泌型细胞标记基因的表达;(5)采用qPCR和免疫印迹检测IFN-γ处理后肠类器官Wnt和Notch信号通路相关基因的表达。[研究结果]1.IFN-γ调控肠上皮细胞程序性坏死:(1)实验性结肠炎中Ifn-γ的表达与程序性坏死标记基因Ripk3和Mlkl的表达呈正相关,且随着结肠炎的严重程度表达增加,结肠炎恢复阶段表达Ifn-γ,Ripk3和Mlkl的表达也逐渐减少;(2)ENR和WRN两种培养基中,IFN-γ处理都能够抑制肠类器官正常生长,且肠类器官存活数目随着IFN-γ浓度的增加逐渐减少;(3)采用PI、剪切型Caspase3/7染色及流式检测表明IFN-γ处理导致肠类器官细胞大量死亡。荧光定量PCR和免疫印迹结果显示细胞凋亡标记基因Caspase3和Caspase8、以及程序性坏死标记基因Ripk3和Mlkl等显著上调;(4)相较于泛Caspase抑制剂zVAD,可抑制程序性坏死的RIPK1(Receptor-interacting serine/threonine-proteinkinase 1)抑制剂 Necrostatin-1(Nec-1)能够更好地挽救IFN-γ引起的肠类器官死亡。Ripk3和Mlkl基因敲除的小鼠肠类器官经IFN-γ处理后能够正常生长;(5)双报告基因实验显示,在Hela细胞中,IFN-γ可以通过pSTAT1激活Mlkl基因的启动子,增加Mlkl的转录水平;(6)体外培养的肠类器官培养基中添加JAK inhibitor I抑制JAK/STAT1信号通路,能够挽救IFN-γ引起的肠类器官损伤,提高肠类器官存活数目;(7)过量的IFN-γ注射会损伤小鼠肠黏膜,导致肠上皮细胞大量死亡。同时过量的IFN-y可激活肠上皮细胞的JAK/STAT1通路,并增加程序性坏死标记分子RIPK3和MLKL的表达。2.IFN-γ调控肠上皮细胞增殖分化:(1)IFN-γ处理增加体外培养的小鼠肠类器官的体积,加快肠上皮细胞的增殖,上调CyclinD1基因表达,并下调TA细胞标记基因的表达;(2)IFN-γ处理减少小鼠肠类器官中Lgr5+肠干细胞数量,Lgr5、Olfm4等活跃肠干细胞标记基因基本不表达,Bmi1、Lrig等静息肠干细胞标记基因的表达也明显减少。另外胚胎型肠干细胞标记基因Sca1表达显著增加;(3)IFN-γ处理引起肠类器官中吸收型肠上皮细胞标记分子的mRNA和蛋白表达显著降低,阻碍了吸收型肠上皮细胞的成熟和分化;(4)IFN-γ处理导致肠类器官中分泌型肠上皮细胞数目减少,各种分泌性型细胞的标记基因表达也明显降低;(5)IFN-γ处理导致肠类器官中Wnt3和下游β-catenin、Axin2等基因的mRNA表达显著降低,Notch信号通路配体Dll1、Jagged1等和受体Notch1、Notch2等的mRNA表达也显著减少,表明Wnt和Notch信号通路受到抑制。[结论和意义]综合以上研究结果可以得出以下结论:(1)我们通过小鼠体内和肠类器官体外培养等实验,发现过量的IFN-γ可激活肠上皮细胞JAK/STAT1通路并增加STAT1的磷酸化水平,从而上调程序性坏死基因Mlkl的表达,进而导致肠上皮细胞发生程序性坏死和肠黏膜屏障功能损伤。阻断程序性坏死或JAK/STAT1通路能够减轻过量IFN-γ对肠上皮细胞造成的损伤;(2)我们通过体外肠类器官培养实验,发现IFN-γ处理可加快肠类器官增殖,但也能抑制Wnt和Nocth信号通路,影响肠上皮细胞的干性维持和分化,导致成体肠干细胞、TA细胞和成熟肠上皮细胞(包括吸收型和分泌型)数量显著减少。值得注意的是,IFN-γ处理可导致体外培养肠类器官中胚胎型干细胞标记基因表达量增加。根据上述研究结果,我们揭示了炎症因子IFN-γ调控肠上皮细胞程序性坏死和上皮细胞增殖及分化的分子机制,阐明了 IFN-γ通过破坏上皮细胞的结构完整性来损害肠黏膜屏障功能,从而加重肠炎并阻碍肠炎的损伤后修复。我们的研究有助于深入解析IFN-γ等炎症因子在调节肠上皮细胞稳态中的作用机制,为临床上以此类炎症因子为靶点,开发新型炎症性肠病治疗药物提供借鉴。