胶原蛋白是人体内含量最多的蛋白质,起着维持组织和器官结构完整性的作用。它在内质网（ER）中的折叠和组装需要多种辅助蛋白的参与,如脯氨酸3-羟化酶（P3H）、脯氨酸4-羟化酶（P4H）、分子伴侣HSP47等。其中脯氨酸3-羟化酶复合物（P3H1/CRTAP/PPIB）可以特异性地羟化I型胶原α1链986位的脯氨酸,同时该复合物还具有二硫键异构酶和脯氨酰顺反异构酶的活性。大量临床研究发现该复合物中任一组分的缺失均会导致胶原蛋白的错误折叠和成骨不全症（OI）的发生。然而P3H1复合物中这三个蛋白如何相互作用并定位于内质网中的分子机制并不清楚,且该复合物特异性地3-羟基化胶原的结构生物学机制也未明确。针对这些问题,我们首先分析了三元复合物在内质网中驻留及组装的分子机制。由于构成复合物的三个蛋白中只有P3H1拥有内质网驻留信号KDEL序列,为此我们删除了位于P3H1羧基末端的该序列,并检测了其对复合物定位的影响。我们发现该信号肽的去除导致P3H1和CRTAP共分泌到胞外,而且共分泌是通过P3H1的氨基端结构域和CRTAP相互作用所介导。体外组装实验证实,共分泌的P3H1/CRTAP复合物可以和PPIB蛋白形成三元复合物,这为鉴定三元复合物中PPIB的结合表面奠定了基础。通过选择性突变PPIB分子表面的氨基酸为半胱氨酸,并分析这些PPIB变体与P3H1/CRTAP形成复合物后半胱氨酸的暴露情况,我们发现在三元复合物中PPIB分子表面大部分区域被P3H1及CRTAP覆盖。一个胶原蛋白合成异常相关的PPIB病理性突变位于PPIB结合表面上,且该突变体具有正常的脯氨酰异构酶活性,但它基本上丧失了与P3H1和CRTAP形成三元复合物的能力,这提示P3H1三元复合物的完整性而不仅仅其中某一成分的活性,在原胶原合成过程中起了至关重要的作用。为了阐述P3H1复合物羟化胶原的分子机制,我们解析了P3H1羟化酶结构域的晶体结构（分辨率为1.95?）以及其同源蛋白P3H3的羟化酶结构域晶体结构（分辨率为2.1?）。这些结构显示,脯氨酸3-羟化酶催化结构域与研究较为透彻的脯氨酸4-羟化酶均属于双加氧酶家族,两者发挥酶活性需要亚铁离子、2-氧戊二酸盐（2-OG）、O2和抗坏血酸的辅助。它们存在高度保守的双链-螺旋（DSBH）区及活性中心的关键催化残基His-X-Asp--His-序列。通过与莱茵衣藻P4H（CrP4H）结构及低氧诱导因子-脯氨酸羟化酶结构域蛋白（PHD2）结构的比对我们发现,P3H催化结构域结合胶原底物的方式与P4H显著不同。P4H中参与底物结合的β3-β4为发夹状结构,由25个氨基酸构成,而P3H相应位置的β3-β4 loop扁平松散,仅由15个氨基酸构成。另外P3H活性位点附近存在一个保守的组氨酸（P3H1-His584;P3H2-His577以及P3H3-His581）,而P4H相应位点为保守的酪氨酸。分子对接模型显示该组氨酸可以与胶原序列中987位羟脯氨酸的羟基形成稳定氢键,从而让986位脯氨酸的C3原子与金属离子处于合适的位置。该模型可以解释P3H1复合物优先作用于含有987位4-羟脯氨酸的胶原底物分子的现象。总之以上研究揭示了P3H1复合物主要通过P3H1末端的KDEL序列定位于内质网中,且三元复合物的完整性对胶原的合成至关重要。同时脯氨酸3-羟化酶催化功能域的晶体结构显示其结合口袋显著不同于4-羟化酶,这为我们进一步了解三元复合物在胶原合成过程中的作用机制奠定了基础。