[目的]烧伤是平时和战时较为常见的外伤,挽救烧伤患者的关键是尽早封闭创面。最近的研究发现,间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）能有效缓解创面的炎症反应,促进创面成纤维细胞的增殖和迁移。基于MSCs促进创面愈合的作用,本研究将分离培养的人脐带间充质干细胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUC MSCs）,通过体外实验来探究hUC MSCs能否通过调节自噬效应促进烧伤创面的修复,同时观察hUC MSCs对烧伤微环境中局部成纤维细胞的影响,探讨其具体的机制,为严重烧伤创面的临床治疗提供新的理论依据。[方法]1、hUC MSCs细胞提取、培养与鉴定:采取组织块贴壁法分离hUC MSCs并培养。倒置相差显微镜观察细胞形态结构;流式细胞术鉴定细胞表面标志物CD34、CD45、CD90、CD105和Oct-4的表达情况;油红O染色、茜素红染色法对细胞成脂和成骨的分化能力进行鉴定。2、将鉴定合格的细胞分组培养,给予浓度为0.03μM、0.3μM、3μM的雷帕霉素（Rapamycin）和浓度为 0.3nM、3nM、30nM 的 3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）处理,培养于1d、2d、3d、4d、5d后加入CCK-8检测细胞活性,获得最佳作用浓度和作用时间。然后采取严重烧伤患者的血清模拟烧伤微环境培养hUC MSCs,实验分组为10%正常血清+hUC MSCs组、10%烧伤血清+hUC MSCs组、10%烧伤血清+hUC MSCs+DMSO 组、10%烧伤血清+hUCMSCs+3-MA（0.3nM）组、10%烧伤血清+hUCMSCs+雷帕霉素（0.03μM）组。培养3d后,WB检测自噬相关蛋白Lc3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclinl的表达情况;外源GFP-LC3荧光自噬指示体系标记及追踪LC3B的变化;CCK-8法检测hUC MSCs的增殖情况。3、模拟烧伤微环境,在Transwell细胞共培养体系中将hUC MSCs与成纤维细胞（Human dermal fibroblast,HDF）共培养。实验分组为HDFa+10%正常血清（上室）/10%正常血清（下室）（模拟重力）、HDFa+烧伤血清（上室）/烧伤血清（下室）、HDFa+烧伤血清（上室）/hUC MSCs+烧伤血清（下室）、HDFa+烧伤血清（上室）/hUC MSCs+烧伤血清+DMSO（下室）、HDFa+烧伤血清（上室）/hUC MSCs+烧伤血清+雷帕霉素（下室）、HDFa+烧伤血清（上室）/hUC MSCs+3-MA+烧伤血清（下室）共6组。培养3d后,使用细胞免疫荧光化学染色法检测成纤维细胞的Ⅰ 型胶原（collagen type Ⅰ,Col-1）及 Ⅲ 型胶原（collagen type Ⅲ,Col-3）表达情况。使用ELISA检测hUC MSCs中TGF-β1,PGE-2,IL-10,IDO和IL-6的分泌水平以及自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和p62的表达情况。[结果]1、hUC MSCs细胞提取、培养与鉴定:组织贴壁法获得原代细胞,在组织块周围形成70%-80%的融合,细胞形态呈多角形,且不规则,细胞体积较大;当细胞传到P1代时,细胞仍呈多角形,体积较大;细胞传至P2代后,细胞形态逐渐变细变长,以长梭形为主,仍有部分细胞为多角形;P3代-P5代细胞呈长梭形,漩涡样生长。待P5代细胞80%-90%融合,流式细胞术检测显示细胞高表达CD90和CD105,不表达CD34和CD45,细胞阳性表达多能干细胞分子标志Oct-4。在hUCMSCs诱导成骨培养28天后,在显微镜下观察到钙结节,经茜素红染色后呈现致密红色结节。hUC MSCs经成脂诱导培养28天后,显微镜下可见小而圆的脂肪小泡,油红0染色后呈橙红色。这些结果表明,组织块贴壁培养获得的细胞符合MSCs特异性分子表达特征,且具有成骨和成脂分化潜能。2、WB检测相关信号通路AKT/mTOR的标志蛋白。按实验分组设置相应对照组,培养3d后,检测自噬相关蛋白Lc3Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclinl的表达情况。结果显示:10%烧伤血清+hUC MSCs组较10%正常血清+hUC MSCs组的LC3Ⅱ/Ⅰ、p62和Beclin1的表达量有意义（P<0.01）,提示烧伤血清能刺激hUC MSCs的自噬效应;10%烧伤血清+hUC MSCs+雷帕霉素组较10%烧伤血清+hUC MSCs组的LC3ⅡⅡ/Ⅰ、Beclin1的表达量增多（P<0.01）,p62的表达量减少（P<0.05）,说明雷帕霉素促进烧伤创面微环境中hUC MSCs的自噬效应;10%烧伤血清+hUC MSCs+3-MA组较10%烧伤血清+hUC MSCss组的LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的表达量降低（P<0.05）,p62的表达量上调,但无统计学意义。WB实验验证了烧伤血清能刺激hUC MSCs的自噬效应,同时雷帕霉素可以进一步促进烧伤创面微环境中hUC MSCs的自噬效应,3-MA抑制了烧伤创面微环境中hUC MSCs的自噬效应;检测外源GFP-LC3荧光自噬指示体系标记及追踪LC3的变化,进一步验证了这一结论;此外,CCK-8法检测细胞增殖情况得出烧伤微环境能有效刺激hUC MSCs的增殖和存活,雷帕霉素能进一步促进hUC MSCs在烧伤环境中的增殖和存活,而3-MA抑制了 hUC MSCs在烧伤环境中的增殖和存活,DMSO的剂量并未对hUC MSCs产生毒副作用。3、在Transwell细胞共培养体系中,细胞免疫荧光检测Collagen Ⅰ和CollagenⅢ表达,结果显示:烧伤微环境中的hUC MSCs可以使创面成纤维细胞的Ⅰ型胶原（Collagen type Ⅰ,Col-1）及 Ⅲ 型胶原（Collagen type Ⅲ,Col-3）表达增加,促进 hUC MSCs的自噬水平后,可以进一步增加创面HDFa的Col-1及Col-3的表达,反之则降低。经ELISA检测hUC MSCs中TGF-β1,PEG-2,IL-10,IDO和IL-6的分泌水平,以及MSC自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和p62的表达。结果显示现TGF-β1的分泌与hUC MSCs自噬相关蛋白呈LC3Ⅱ/Ⅰ正相关,PGE-2的分泌与hUC MSCs自噬相关蛋白p62呈正相关。[结论]1、经组织块贴壁法培养获得的细胞符合hUC MSCs特异分子表达特性,且具有多项分化潜能。2、烧伤环境能刺激hUC MSCs的自噬效应,使得间充质干细胞的增殖和存活能力增强;且激活hUC MSCs的自噬效应可进一步增强间充质干细胞在烧伤创面微环境的的增殖和存活能力。3、激活hUC MSCs的自噬效应可促进烧伤微环境中成纤维细胞的增殖和迁移;且自噬可能通过诱导创面移植的间充质干细胞旁分泌TGF-β1,同时抑制创面的炎症反应来发挥作用的。