2012年在中东地区暴发的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)是继2002年暴发的严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)之后又一高致病性冠状病毒。截至2017年3月,MERS-CoV共造成1917人感染,684人死亡,病死率高达36%,波及27个国家。冠状病毒(Coronavirus)是带有囊膜的单股正链非节段RNA病毒。根据基因型和血清型特性,冠状病毒分为四个属:α β、γ、δ。迄今为止,确定能够感染人的冠状病毒有六种,分别是hCoV-NL63、hCoV-229E、hCoV-OC43、hCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV,其中前两种冠状病毒属于α属,后四种属于β属。MERS-CoV和SARS-CoV均会引起严重的肺部疾病,是威胁人类生命健康和财产安全的病原体。刺突蛋白(spike glycoprotein,S蛋白)是冠状病毒重要的结构蛋白。它是位于病毒囊膜表面的同源三聚体蛋白,参与受体结合和膜融合过程,不仅是决定宿主特异性的关键因素,还是中和抗体重要的靶向分子。S蛋白胞外段在蛋白酶的作用下能够被切割成位于N端的S1区和靠近病毒囊膜的C端S2区。S1 区负责结合受体,S2负责病毒与宿主细胞的膜融合过程。S1区域包含两个相对独立的结构域:N 端结构域(N-terminaldomairNTD)和 C 端结构域(C-terminaldomain CTD)。MERS-CoV 就可以利用 CTD 中的受体结合区(receptor binding domain RBD)结合受体二肽基肽酶 4(dipeptidyl peptidase 4,DPP4),也称为 CD26。为了揭示冠状病毒的入侵过程和跨种传播机制,我们需要充分了解S蛋白的结构与功能以及S蛋白与受体的相互作用。利用冷冻电镜技术解析的鼠肝炎病毒S蛋白,作为第一个冠状病毒S蛋白结构,为冠状病毒研究领域提供了重要的指导意义。鉴于MERS-CoV和SARS-CoV的高致病性及其S蛋白结构未知的现状,我们首先将关注的重点放在这两种冠状病毒S蛋白的结构研究中。此外,虽然有多项研究表明MERS-CoV是动物源性病毒,但是它的传播途径以及跨种传播机制并不是十分清楚。因此,本研究从受体CD26的角度去探讨MERS-CoV可能的宿主并将从分子层面解释病毒的跨种传播机制。首先,本研究利用单颗粒冷冻电镜技术解析了近原子分辨率的MERS-CoV和SARS-CoV处于融合前构象的S蛋白结构。两种病毒的S蛋白在整体结构上与已经报道的其他冠状病毒类似,但是其受体结合区存在明显差异。我们捕获到两种状态的RBD:一种是包埋状(buried)(横卧状,lying state),另一种是暴露状(exoosed)(站立状,standing state)。已报道的冠状病毒(MHV、hCoV-HKU1和hCoV-NL63)的RBD均呈横卧状,目前只在MERS-CoV和SARS-CoV中观察到站立状RBD。结构分析显示,横卧状的RBD将受体结合位点包埋在S蛋白中,而站立状RBD的受体结合位点是暴露的,这种构象有利于受体的结合。一些冠状病毒,如牛冠状病毒(BCoV)和鼠肝炎病毒(MHV)利用NTD结合糖或者受体分子以达到对宿主细胞的粘附和入侵目的,而有些病毒则利用CTD结合受体。此前对MERS-NTD和SARS-NTD的结构和功能并不清楚。因此我们利用X射线晶体学方法解析了 MERS-NTD和SARS-NTD的结构。结果显示这两种NTD的糖结合区具有短螺旋结构和糖分子,因而无法通过结合糖来完成病毒对细胞的粘附。此外,通过对感染人的六种冠状病毒S蛋白的保守性分析发现,S2中的融合肽、七肽重复区1以及中心螺旋相对保守且易于接近,是寻找广谱性中和抗体和抑制剂的理想靶点。其次,虽然蝙蝠被认为是冠状病毒的天然宿主,但是MERS-CoV在蝙蝠中的感染情况以及入侵机制还知之甚少。为了研究MERS-CoV对不同蝙蝠的感染能力,我们表达了七种蝙蝠的CD26,进一步的表面等离子共振技术(SPR)分析发现它们与MERS-RBD的结合能力不同:其中,亲和力最高的为大卫鼠耳蝠(Myotis davidii)CD26,而伏翼蝠(Pipistrellus pipistrellus)CD26 几乎不结合MERS-RBD。流式细胞荧光分选术(FACS)和假病毒实验证实MERS-CoV能够通过结合蝙蝠CD26感染细胞。此外,本研究解析了大卫鼠耳蝠CD26与MERS-RBD的复合物晶体结构,从分子层面上解释了两者相互作用的结构基础。整体上蝙蝠CD26和MERS-RBD的结合与人CD26和MERS-RBD的作用方式类似。蝙蝠CD26的295位和336位氨基酸在与MERS-RBD相互作用中起到重要作用。实验结果显示,MERS-CoV对多种蝙蝠具有潜在感染能力,所以在MERS-CoV的防治中需要加强对不同种类蝙蝠的监控力度。此外,本研究还通过对不同物种CD26与MERS-RBD的结合情况分析,初步探讨了 MERS-CoV对不同物种的感染能力,为寻找潜在的中间宿主打下基础。MERS-RBD能够结合多个物种的CD26分子,如猴子、单峰驼、猪等,但不能结合猫、狗和鼠的CD26。虽然猪CD26与MERS-RBD的结合能力比人CD26低,但是MERS-CoV假病毒可以利用猪CD26作为受体感染细胞。为了进一步研究猪CD26与MERS-RBD之间的相互作用,我们利用晶体学方法解析了两者的复合物结构。晶体结构显示,与人CD26和MERS-RBD相比,猪CD26和MERS-RBD之间相互作用面积小且作用力弱,这可能就是猪CD26与MERS-RBD的亲和力比人CD26低的原因。有趣的是,猪CD26中339位的丝氨酸虽然不直接参与受体的结合,但是却能在很大程度上影响猪CD26与MERS-RBD的亲和力。S339C突变在C339和C328之间形成一个二硫键,而仅仅是该位点的单一突变就能将猪CD26与MERS-RBD之间的亲和力提高1000倍。这些结果说明MERS-CoV可能能够感染猪,为了验证这个结论,我们还在实验条件下用MERS-CoV感染丹麦长白猪(Danish Landrace piglet)。动物感染实验显示,尽管受试个体无明显的临床症状,但在其体内能检测到病毒复制以及抗体的存在。综上所述,本研究通过冷冻电镜技术解析了 MERS-CoV和SARS-CoV S蛋白的结构。S蛋白中不同状态RBD的存在说明病毒在与受体结合之前RBD需要进行构象变化从而暴露出受体结合位点,S蛋白的结构加深了我们对病毒入侵机制的理解。此外,利用X射线晶体学方法对MERS-RBD与蝙蝠CD26、MERS-RBD与猪CD26复合物结构的解析,结合生化、细胞实验说明MERS-CoV能够与多个物种的CD26分子结合,虽然结合力有所不同,但是也预示了MERS-CoV对不同物种存在潜在的感染能力。动物实验证明MERS-CoV能够感染猪,在MERS-CoV的传播过程中猪可能起到重要作用。这些结果有利于深入理解MERS-CoV的入侵过程和跨种传播机制,对冠状病毒感染的预防与治疗起到重要的指导意义。