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【目的】对比剂所致急性肾损伤(contrast-induced acute kidney injury,CI-AKI)为住院患者新发急性肾功能不全的第三大常见病因,其病理特征主要表现为肾小管的大范围坏死。细胞焦亡是一种裂解的调控性细胞死亡方式,在细胞死亡过程中伴炎症因子的释放,这一过程是由炎症性半胱氨酸蛋白酶-4/5/11(caspase-4/5/11)和半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)调控的细胞膜破裂引起。本研究拟探讨:1.Caspase-11调控的肾小管上皮细胞焦亡在CI-AKI中的作用及其机制;2.NLRP3/Caspase-1调控的肾小管上皮细胞焦亡在CI-AKI中的作用及其机制。【方法】1.体外实验:人和小鼠肾小管上皮细胞培养。根据预实验结果,拟使用碘海醇(20 mg/ml)刺激肾小管上皮细胞72小时建立CI-AKI细胞实验模型,碘海醇为非离子低渗含碘对比剂。实验共分为以下12组:1.正常对照组;2.碘海醇组;3.甘露醇组;4.碘海醇+pan caspase抑制剂(Z VAD FMK)组;5.碘海醇+Caspase-4 si RNA组;6.甘露醇+Caspase-4 si RNA组;7.碘海醇+Caspase-5 si RNA组;8.甘露醇+Caspase-5 si RNA组;9.碘海醇+Nlrp3si RNA组;10.甘露醇+Nlrp3 si RNA组;11.碘海醇+Caspase-1 si RNA组;12.甘露醇+Caspase-1 si RNA组。通过Western Blot方法检测细胞内Caspase-4/5/11、NLRP3、Caspase-1、IL-1和Gsdmd的蛋白表达,并使用专用试剂盒(FLICATM Caspase-1 Assay Kit,Immunochemistry Technologies)检测细胞内Caspase-1活性。细胞内Caspase-4/5、NLRP3、Caspase-1和IL-1m RNA表达使用real-time PCR检测。细胞培养上清中IL-1浓度使用ELISA方法检测。乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(Promega)测定细胞LDH释放,评估细胞膜完整性。2.体内实验:建立CI-AKI小鼠模型。共有野生型、Caspase-11基因敲除、NLRP3基因敲除、和Caspase-1基因敲除4种小鼠。每种小鼠分为以下4组,每组6只:第一组:正常对照组(该组小鼠不做处理);第二组:model组(单侧肾切除3周后,禁水1天后经尾静脉注入速尿(10μl/g));第三组:model+碘海醇组(单侧肾切除3周后,禁水1天后经尾静脉注入速尿(10μl/g),20分钟后经尾静脉注入碘海醇(10μl/g));第四组:model+生理盐水(NS)组(单侧肾切除3周后,禁水1天后经尾静脉注入速尿(10μl/g),20分钟后经尾静脉注入NS(10μl/g))。所有组别小鼠于碘海醇或药物注射后24小时处死,于处死当日收集小鼠血液和肾脏组织标本。全自动生化分析仪检测小鼠血肌酐(serum creatinine,SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)评估肾功能;Western Blot方法分别检测小鼠肾脏组织中Caspase-11、NLRP3、Caspase-1、IL-1和Gsdmd的蛋白表达;肾组织中急性肾损伤生物标志物(KIM-1、IL-18)和炎症因子IL-6 m RNA的表达使用real-time PCR检测。H&E染色观察肾小管损伤程度;免疫组化染色检测肾脏组织中Caspase-11、NLRP3、Caspase-1和IL-1表达,并定位细胞焦亡的靶细胞。【结果】体外实验:1.对比剂通过炎症性caspases调控肾小管上皮细胞焦亡。碘海醇刺激72小时后,肾小管上皮细胞培养上清中IL-1β分泌明显升高,并呈剂量依赖性(p<0.0001),且细胞中Caspase-4/5/11和NLRP3、Caspase-1蛋白表达明显升高(p<0.0001)。同时,细胞中Caspase-4/5和NLRP3、Caspase-1 m RNA表达明显升高(p<0.0001)。碘海醇刺激促使人肾小管上皮细胞裂解,LDH释放增加,而这一作用可被pan caspase抑制剂Z-VAD-FMK阻断,且应用pan caspase抑制剂Z-VAD-FMK后,细胞培养上清中IL-1β分泌明显降低(p<0.0001)。2.Caspase-4/5/11和NLRP3/Caspase-1参与对比剂引起的肾小管上皮细胞焦亡。Caspase-11基因敲除、Caspase-4/5和Nlrp3、Caspase-1基因沉默均可显著降低肾小管上皮细胞裂解和细胞中IL-1β蛋白和m RNA的表达及分泌(p<0.0001)。3.Gsdmd蛋白活化是对比剂引起肾小管上皮细胞焦亡发生的重要分子机制。对比剂上调肾小管上皮细胞中细胞膜孔形成蛋白Gsdmd活化蛋白Gsdmd p30的表达,而Caspase11、NLRP3、Caspase-1基因敲除可显著降低Gsdmd p30蛋白的表达(p<0.0001)。体内实验:1.对比剂可引起急性肾损伤伴肾组织内炎症。对比剂可引起肾小管上皮细胞肿胀、脱落、空泡变性和肾小管坏死,伴SCr和BUN明显升高,同时肾组织中急性肾损伤生物标志物(KIM-1和IL-18)和炎症因子IL-6 m RNA表达升高(p<0.0001)。2.对比剂可引起Caspase-11和NLRP3/Caspase-1炎症体通路激活,促进肾小管上皮细胞焦亡发生。对比剂所致急性肾损伤肾组织中Caspase-11、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达明显升高(p<0.0001)。3.Caspase-11和NLRP3/Caspase-1炎症体参与对比剂引起的急性肾损伤和肾小管上皮细胞焦亡。Caspase-11、NLRP3、Caspase-1基因敲除可明显减轻对比剂所致急性肾损伤,降低SCr和BUN水平,IL-1β的表达和减轻肾组织炎症(p<0.0001)。4.Gsdmd蛋白活化是对比剂引起肾小管上皮细胞焦亡发生的重要分子机制。对比剂上调肾组织中细胞膜孔形成蛋白Gsdmd活化蛋白Gsdmd p30的表达,而Caspase11、NLRP3、Caspase-1基因敲除显著降低Gsdmd p30蛋白的表达(p<0.0001)。【结论】1.对比剂可引起肾小管上皮细胞焦亡;2.肾小管上皮细胞焦亡参与CI-AKI的发生;3.CI-AKI中肾小管上皮细胞焦亡可由Caspase-4/5/11和NLRP3/Caspase-1两条炎症体通路共同调控;4.Gsdmd蛋白活化是Caspase-4/5/11和NLRP3/Caspase-1炎症体通路调控肾小管上皮细胞焦亡发生的重要分子机制。