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血管成形术和支架植入术是当前治疗肺动脉狭窄、冠状动脉粥样硬化等先天性或后天性血管狭窄性疾病的主要方法,术中对内皮的机械损伤、炎症反应可导致血管新生内膜过度增生、血栓形成,术后再狭窄（Restenosis,RS）发生率高。抗增殖药物紫杉醇（Paclitaxel,PTX）有助于减轻炎症,防治术后再狭窄;然而水溶性差,大剂量使用时可出现严重不良副作用。如何增加靶区PTX的剂量,减轻毒副作用是目前亟待解决的问题。因此,本研究试图从炎症部位存在代谢性酸中毒入手,设计一种携载PTX的pH响应型纳米粒,通过体内和体外实验评价其可行性、安全性和有效性。目的探究载PTX的pH响应型纳米粒防治血管再狭窄的可行性、安全性和有效性,为防治血管再狭窄提供新思路。方法1.采用双乳法制备载紫杉醇的pH响应型纳米粒,并进行表征:透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）和扫描电子显微镜（Scanning electron microscope,SEM）观察PTX-Na HCO3-PLGA NPs的结构形态。马尔文粒度仪检测其粒径和电位。傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR）检测其分子结构和化学键特性。pH酸度计检测其pH稳定性。紫外分光光度计检测纳米粒的载药率、包封率和释放率。2.验证载紫杉醇的pH响应型纳米粒的安全性:（1）细胞活性实验:将PTX-Na HCO3-PLGA NPs和Na HCO3-PLGA NPs与细胞共孵育,酶标仪检测并计算细胞活性;（2）溶血试验:将不同浓度的PTX-Na HCO3-PLGA NPs与红细胞共孵育,计算溶血率;（3）体内安全性:将9只雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（250-300 g）随机分为3组（PTX-Na HCO3-PLGA NPs组、单纯PTX组和PBS对照组）,分别经尾静脉注射1 m L PTX-Na HCO3-PLGA NPs（2 mg/kg PTX）、1 m L单纯PTX（2 mg/kg PTX）以及1 m L PBS。在注射后的第1、3、7和14天收集血样进行血液生化检测。采集大鼠主要器官（心、肝、脾、肺和肾）,制备组织切片,用H＆E染色。3.检测颈动脉内皮损伤部位的pH值:在建模后的第4、7、10和14天收获正常大鼠的颈动脉和模型大鼠的受伤血管,并用OCT包埋。将冷冻切片用2′,7′-双（2-羧基乙基）-5-（和-6）-羧基荧光素-乙酰氧甲基溶液（BCECF AM）孵育30分钟,用PBS洗三次,密封,并用激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope,LSCM）拍照。4.PTX-Na HCO3-PLGA NPs防治血管再狭窄的评价:将大鼠分为5组（假手术组、模型组、Na HCO3-PLGA NPs组、单纯PTX组、PTX-Na HCO3-PLGA NPs组）,每组5只,分别在建模后即刻、第5天、第10天给药（1 mg/kg PTX）。第14天大鼠被安乐死,将损伤的血管固定于4%的多聚甲醛中,石蜡包埋,切片,并常规H＆E染色。用光学显微镜对切片进行拍照,用Image J软件对图像进行分析。测量内膜和中膜面积,以内膜面积与中膜面积的比率计算内膜增生指数。此外,颈部组织切片用平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）和增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）抗体染色,光学显微镜拍照,Image J进行定量分析。结果1.在SEM和TEM的观察下,纳米粒具有规则的球形形状。马尔文粒度仪测量的PTX-Na HCO3-PLGA NPs的粒径为（255.2±7.7）nm,粒度分布相对较窄,平均Zeta电位为（-12.0±2.4）m V。PTX的药物包封率和载药率分别为73.6±3.4%和4.4±0.2%。5天内,PTX-Na HCO3-PLGA NPs溶解在PBS中时,其平均粒径和pH值没有明显变化,PTX-Na HCO3-PLGA NPs具有的稳定性。相对于单纯的PTX,FT-IR结果显示PTX-Na HCO3-PLGA NPs在1645 cm-1处的特征峰移至1663cm-1,表明PTX与PEG之间可能存在部分相互作用。与中性环境（pH7.4）相比,微酸性环境（pH 5.0,6.0）中PTX的释放明显加快,超过一半的药物在24小时内释放,这表明PTX-Na HCO3-PLGA NPs具有良好的pH响应性。2.对于PTX-Na HCO3-PLGA NPs和Na HCO3-PLGA NPs,在不同的药物浓度剂量下检测其毒性。即使在200 mg/ml的最大浓度下,也观察到了较高的细胞存活率。这表明纳米粒具有良好的生物相容性和选择性。为了评估PTX-Na HCO3-PLGA NPs的体内安全性,我们进行了溶血和血液生物化学检测。当PTX浓度为256μg/ml时,溶血率达到5.88±0.02%,PTX-Na HCO3-PLGA NPs在其他实验浓度下都显示出良好的安全性。PTX-Na HCO3-PLGA NPs组和单纯PTX组的血液生化参数与PBS组无明显差异。此外,根据H＆E染色,在主要器官如心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏没有观察到明显的病理损伤。基于这些结果,我们得出结论,PTX-Na HCO3-PLGA NPs具有良好的生物安全特性。3.颈动脉内皮损伤部位的pH值的检测实验显示:正常动脉呈绿色荧光,其荧光强度随着损伤时间的增加而逐渐降低,表明损伤部位的pH值随着损伤时间的推移逐渐降低。损伤后第14天,内膜的绿色荧光强度明显下降,表明损伤部位的pH值明显降低,变成了微酸性,这可能与球囊损伤引起的炎症反应和随之产生的各种酸性代谢产物有关。4.PTX-Na HCO3-PLGA NPs防治血管再狭窄的评价实验显示:对H＆E染色的切片进行定量分析,发现PTX-Na HCO3-PLGA NPs处理明显抑制了VSMCs的增殖,增加了管腔的内径。PTX-Na HCO3-PLGA NPs处理组的内膜面积明显减小（P＜0.01）,表明PTX-Na HCO3-PLGA NPs有效抑制了内膜增生。并且五组间中膜面积没有统计学意义。此外,PTX-Na HCO3-PLGA NPs处理组的内膜增生指数（衡量内膜增生的指标）明显低于其他三组。α-SMA在内膜中的阳性染色面积,生理盐水组明显大于PTX-Na HCO3-PLGA NPs处理组（P＜0.05）,证实了VSMCs的增殖和迁移促进了内膜增生,而PTX有效地抑制了VSMCs的增殖和迁移。细胞增殖标志物PCNA的染色显示,增殖细胞广泛分布于生理盐水组的内膜,而PTX-Na HCO3-PLGA NPs处理组的阳性染色细胞明显减少。这一结果表明,PTX-Na HCO3-PLGA NPs发挥了良好的抗狭窄作用。结论利用高分子生物材料PLGA,成功地构建了pH响应的纳米药物递送平台。在酸性环境中,Na HCO3可产生CO2使PTX-Na HCO3-PLGA NPs分解,从而诱导PTX的释放,最终抑制了VSMCs的增殖。在球囊损伤血管再狭窄的大鼠模型中,PTX-Na HCO3-PLGA NPs比其它药物显示出更好的抗狭窄疗效和良好的安全性。因此,载PTX的pH响应型纳米粒是治疗血管再狭窄的潜在药物。