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目的：
通过尾静脉向心肌梗死大鼠移植骨髓间充质干细胞,探讨SCF和G-CSF对MSCs归巢到心肌梗死区的作用,并验证在梗死心肌组织中定向分化为心肌细胞的可能性及安全性,为干细胞移植技术用于心肌梗死的临床治疗提供动物实验依据。
[方法]
无菌条件下取出大鼠双侧股骨,冲洗骨髓腔获得骨髓细胞,贴壁筛选法纯化MSCs并进行体外培养扩增。结扎法建立大鼠心肌梗死模型,采用DAPI标记细胞,于心肌梗死模型建立一周后尾静脉注入心肌梗塞模型鼠,根据分组情况,于细胞移植前后三天皮下注射SCF和G-CSF。在移植MSCs四周后处死大鼠,心脏冰冻切片观察心肌梗死区移植细胞的分布情况,采用计数方法比较注射不同细胞因子组的MSCs数量,荧光免疫组化检测植入MSCs肌钙蛋白(cTnI)的表达。
结果：
1.采用贴壁刷选法可获得较纯的MSCs,体外培养过程中细胞呈梭形贴壁生长,扩增速度快,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CD29和CD44阳性率分别为94.1％和92.6%,CD34和CD45阳性率分别为3.3%和4.1%,细胞形态均一,数量足够,可满足细胞移植需要。
2.结扎左冠状动脉前降支可成功建立大鼠急性心肌梗死动物模型,结扎血管远端供血区心肌组织颜色苍白,心电图动态检测到ST段持续性抬高及病理组织切片作为模型制作成功的标志,该方法的结扎成功率为56%。
3.DAPI细胞标记率为100%,敏感性和特异性高。
4.MSCs植入四周后冰冻切片,荧光显微镜下观察,MSCs迁移至梗死心肌组织,MSCs组、SCF组、G-CSF组迁移至梗死心肌组织的MSCs数量没有明显区别(P＞0.05),SCF+G-CSF组的MSCs数量明显高于其它三组,差异具有统计学意义(P＜0.01)。免疫荧光组织化学显示,植入的部分MSCs表达心肌特异蛋白cTnI。
结论：
1.贴壁培养法可分离扩增得到高纯度,足够数量的MSCs,该方法简单易行。
2.左冠状动脉结扎可以建立大鼠心肌梗死模型。
3.MSCs可通过外周静脉移植迁移至梗死心肌组织,SCF+G-CSF两种细胞因子联合应用可以促进MSCs归巢至心肌梗死区域,在体内微环境的诱导下,MSCs能够转化为心肌样细胞,免疫荧光组织化学检测心肌特异蛋白可以得以证实。该课题的完成为MSCs的进一步应用打下实验基础。