论文部分内容阅读
背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以进行性认知功能减退为临床特征的神经退行性疾病。由于缺乏早期预防、诊断和治疗AD的有效方法和措施,预计到2050年全球的AD患者将超过9000万人。AD的主要病理学特征是神经元纤维缠结、大量老年斑(senile plaque)形成和神经元缺失。p淀粉肽(β-amyloid peptide,Aβ)是老年斑的主要成分。Aβ可以选择性地增加N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methy-D-aspartate, NMDA)受体活性,通过增加NMDA受体通道的钙离子内流,引起钙超载导致神经元死亡。Sigma-1(σ1)受体是含有223个氨基酸残基的G蛋白偶联受体,在海马等边缘系统中高表达。大量的研究证明,σ1受体能正性调节NMDA受体。我们的前期研究已证明,σl受体激动剂通过提高NMDA受体NR2B亚基的磷酸化水平,能增加海马CA1区锥体细胞的NMDA受体钙离子内流。而σl受体基因敲除或σ1受体拮抗剂都能降低NMDA受体NR2B亚基的磷酸化水平,从而抑制NMDA受体的功能。采用σ1受体配体的PET影像学检测结果显示,AD脑海马和皮层的σ1受体密度和活性明显低于非认知障碍人群。进一步的研究发现,σ1受体密度降低主要发生在迟发性的AD患者脑内。近期的临床检查结果发现,AD患者的σ1受体具有基因多态性。基于这些临床资料和σ1受体生理功能的前期研究,本课题提出的科研假设是,σ1受体减少有可能会通过降低Aβ增加的NMDA受体的钙离子内流,减少Ap诱导神经细胞死亡——拮抗Ap的神经毒性。为了能明确AD脑的σ1受体密度降低是否影响Ap的神经毒性,我们采用σ1受体基因敲除杂合子(σ1R+/-)小鼠,通过脑室内注射Ap建立了σ1受体表达减少和功能降低的AD动物模型。通过阐明σ1受体功能改变在AD病理过程中的作用,为AD的预防和治疗新方法的开拓提供理论依据。目的1.确定61受体缺乏是否影响Ap损害海马神经元和认知功能；2.探讨σ1受体缺乏影响Aβ神经毒作用的分子机制。第一部分方法1.基因型鉴定：提取小鼠尾部DNA,用PCR方法鉴定σ1受体基因敲除杂合子(σ1R+/-)小鼠、σ1受体基因敲除纯合子(σ1R-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠。本研究采用3月龄σ1R+/-小鼠、σlR-/-小鼠和同窝WT小鼠。2.AD动物模型制备和动物分组：采用聚集态的Aβ25-35(6nmol/3μl/mouse)进行侧脑室单侧注射制备动物模型。Aβ25-35-WT小鼠：Aβ25-35处理的WT小鼠；Aβ25-35-σ1R+/-小鼠：Aβ25-35处理的σ1R+/-小鼠；Aβ25-35-σ1R-/-小鼠：Aβ25-35处理的σ1-R/-小鼠。对照组小鼠给予侧脑室内注射溶剂。3.认知行为测试：采用Morris水迷宫和Y迷宫的检测技术分析空间认知功能。4.组织细胞检查：采用甲苯胺蓝染色海马脑片,进行海马CA1和CA3区锥体细胞的体视学分析。5.凋亡细胞的检测：用TUNEL染色和Hoechst染色的方法,确定CAl区锥体细胞的凋亡。进行海马CAl凋亡细胞的体视学分析。6.药物处理：Ap注射后1-4天进行σ1受体拮抗剂NE100(1mg/kg)或σl受体激动剂PRE084(1mg/kg)的腹腔注射。结果1.空间认知功能：与WT小鼠相比,σ1R+/-小鼠登台潜伏期没有改变,进臂交替率也没有改变。与WT小鼠相比,Aβ25-35-WT小鼠的登台潜伏期显著延长和进臂交替率明显减少。但是与WT小鼠、σ1R+/-小鼠相比,Aβ25-35-σ1R+/-小鼠的登台潜伏期和进臂交替率都没有明显改变。2.海马CA1和CA3区锥体细胞计数：与WT小鼠相比,σ1R+/-小鼠的锥体细胞数量没有改变,Aβ25-35-WT小鼠的锥体细胞数量比WT小鼠减少大约25%,Aβ25-35-σ1R+/-小鼠的锥体细胞数量却没有明显改变。3.海马CA1区锥体细胞凋亡：WT小鼠和σ1R+/-小鼠几乎没有观察到TUNEL阳性细胞,Aβ25-35-WT小鼠的CA1区发生大量的TUNEL阳性细胞和Hoechst阳性细胞,但是在Aβ25-35-σ1R+/-小鼠的CA1区并没有观察到TUNEL阳性细胞和Hoechst阳性细胞。4.在Aβ25-35-WT小鼠σ1受体拮抗剂的作用：NE100处理能改善Aβ25-35诱导的登台潜伏期延长和进臂交替率降低,海马CA1区锥体细胞死亡。5.在Aβ25-35-σ1R+/-小鼠σl受体激动剂的作用：PRE084处理能加居Aβ25-35-σ1R+/-小鼠的登台潜伏期延长和进臂交替率降低,锥体细胞死亡。结论1.在WT小鼠,Aβ25-35脑室内注射能损害空间认知功能和诱导海马神经元死亡。2.σ1受体基因敲除或σl受体拮抗剂能减弱Aβ25-35损害空间认知功能和诱导海马神经元死亡。第二部分方法1.电生理分析：分别在Aβ25-35处理后48小时或72小时制备海马脑片,通过膜片钳技术检测海马CA1区锥体细胞的NMDA诱导的电流(INMDA)。2.Western blot：分别检测Aβ25-35处理后48小时或72小时的海马NR2B磷酸化。3.药物处理：Aβ注射后1-4天进行NE100(1mg/kg)、NR2B阻断剂Ro25-6981(6mg/kg)、PRE084(1mg/kg)或NMDA(30mg/kg)腹腔注射。结果1.海马CA1区锥体细胞的NMDA诱导电流(INMDA)：与我们在σ1R-/-小鼠的前期研究报道相同,σ1R+/-小鼠的INMDA幅值比WT小鼠减少。在Aβ25-35-WT小鼠,Aβ25-35注射后48小时INMDA幅值增加约2倍,而Aβ25-35注射后72小时降低约40%。与61R+/-小鼠相比,Aβ25-35-σ1R+/-小鼠在Aβ25-35注射后48或72小时的InMDA幅值几乎没有明显改变。2.海马CA1区NR2B磷酸化：与我们在σ1R-/-小鼠的前期研究报道相同,σ1R+/-小鼠的NR2B磷酸化水平明显低于WT小鼠。在Aβ25-35-WT小鼠,Aβ25-35注射后48小时NR2B磷酸化增加约2倍,而Aβ25-35注射后72小时明显降低。与σlR+/-小鼠相比,Aβ25-35-σ1R+/-小鼠在Aβ25-35注射后48或72小时的NR2B磷酸化水平几乎没有明显改变。3.在Aβ25-36-WT小鼠σl受体拮抗剂的作用：NE100处理能阻止Aβ25-35注射后48小时INMDA幅值和NR2B磷酸化的增加,以及Aβ25-35注射后72小时INMDA幅值和NR2B磷酸化的降低。4.在Aβ25-35-01R+/-小鼠σ1受体激动剂的作用：PRE084处理能导致Aβ25-35注射后,48小时INMDA幅值和NR2B磷酸化的增加,以及Aβ25-35注射后72小时INMDA幅值和NR2B磷酸化的降低。5.在Aβ25-35-WT小鼠NR2B阻断剂的作用：to25-6981处理能改善A025-35诱导的登台潜伏期延长和进臂交替率降低,海马CA1区锥体细胞死亡。6.在Aβ25-35-σ1R+/-小鼠NMDA受体激动剂的作用：NMDA处理能加剧Aβ25-35-σ1R+/-小鼠登台潜伏期延长和进臂交替率降低,海马CA1区大量锥体细胞死亡。结论σ1受体缺乏通过抑制Aβ25-35增加NR2B亚基磷酸化导致NMDA受体过活化,阻止钙超载发生,从而减少神经细胞凋亡。