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研究背景急性呼吸窘迫综合征(ARDS)在重症医学科中具有很高的死亡率,而引发ARDS最常见的病因是脓毒症。由重度脓毒症引起的ARDS会触发炎症反应及肺纤维化进程。越来越多的基础实验和临床研究提示肺成纤维细胞的增殖分化在ARDS相关性肺纤维化的发生发展中具有重要的病理意义。然而对ARDS相关性肺纤维化的细胞分子基础的研究至今为止仍然模糊。ICU中ARDS和ARDS相关性肺纤维化的发生率及病死率仍居高不下。认识肺纤维化发病机理并且为减轻纤维化程度提供合适的干预方案,这至关重要。目的通过观察小鼠肺纤维化模型及RhoA激酶抑制剂(法舒地尔)干预后肺组织中RhoA/ROCK1通路相关蛋白的表达。探究法舒地尔对肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)的治疗作用及RhoA/ROCK1通路在纤维化发生发展的作用。在细胞水平通过观察脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)对肺成纤维细胞(MRC-5)RhoA/ROCKl通路活性的影响,并观察RhoA激酶抑制剂法舒地尔对LPS刺激下MRC-5细胞增殖、分化的作用,进一步探讨RhoA/ROCK1通路在MRC-5细胞增殖分化中的作用,进而为ARDS的治疗寻求新的思路。研究方法(1)将90只小鼠,严格按照随机化原则归为3组;对照组(n=30):肺部气溶胶给药套装给予5mg/kg的生理盐水,作为对照每日固定时间腹腔注射生理盐水20mg/kg;脂多糖组(n=30):肺部气溶胶给药套装给予5mg/kg的脂多糖(浓度为1mg/mL),每日固定时间腹腔注射生理盐水20mg/kg/天;法舒地尔组(n=30):肺部气溶胶给药套装给予5mg/kg的脂多糖(浓度为1mg/mL),同样每日固定时间腹腔注射法舒地尔20mg/kg/天。分别于模型成功后第三天、一周、二周、四周每组各麻醉处死5只小鼠,摘取双肺。取左肺放置于洁净空EP管中备用于Western blot,检测第3天肺组织中GTP-RhoA,Rho激酶(ROCK1),肌球蛋白轻链磷酸酶靶亚单位 1(Myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1),p-MYPT1,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;RT-PCR检测α-SMA的mRNA水平。其中右肺置装有福尔马林的小管中,用苏木精-伊红(HE)染色观察组织结构变化。(2)将MRC-5细胞分为四组:空白对照组,LPS组(LPS:10ug/mL),低剂量组(法舒地尔:15umol/mL+LPS:10ug/mL)和高剂量组(法舒地尔:30 umol/mL + LPS:10 ug/mL),细胞去血清培养 24 h。Rho pull-down 分析法测定RhoA 活性;Western blot 检测 GTP-RhoA,ROCK1,MYPT1,p-MYPT1,α-SMA的表达;RT-PCR检测α-SMA的mRNA水平;通过CCK-8试剂盒和EDU细胞增殖(细胞成像)试剂盒测定MRC-5细胞的增殖情况。结果(1)脂多糖组RhoA活性,ROCK1蛋白表达,ROCK1下游底物MYPT1的磷酸化及α-SMA蛋白表达较空白组均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。药物处理组(Fasudil)可显著降低RhoA活性,ROCK1蛋白表达及ROCK1下游底物MYPT1的磷酸化及α-SMA蛋白表达(P<0.05)。对照组肺组织的病理学改变不明显,没有显著的纤维化改变,炎性细胞浸润很少,肺泡间隔无可见增厚。脂多糖组肺组织病理学改变明显,大量炎性细胞浸润,肺泡间隔明显增厚,肺纤维化改变显著;法舒地尔组炎性细胞浸润较少,肺泡间隔稍稍增厚,与脂多糖组相比有轻微的肺纤维化改变。(2)LPS明显上调肺成纤维细胞RhoA活性和ROCK1蛋白表达(P<0.05),增加ROCK1下游底物MYPT1的磷酸化(P<0.05),诱导α-SMA的表达(P<0.05)并且提高细胞增殖率(P<0.05)。法舒地尔(Fasudil,FAS)可以抑制LPS诱导的MRC-5细胞增殖分化,且剂量稍高组法舒地尔的抑制作用更加明显(高剂量组vs低剂量组,P<0.05).结论(1)法舒地尔可以改善脂多糖引起的小鼠肺纤维化的程度。(2)LPS可激活MRC-5细胞RhoA/ROCK1激酶通路,促进MRC-5细胞的增殖、分化。法舒地尔可抑制LPS诱导的MRC-5细胞的增殖、分化,且是通过对RhoA/ROCK1激酶通路的调节。因此,对RhoA/ROCK1信号通路及MYPT1的磷酸化水平的调节可作为肺纤维化治疗的方向。