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目的IgA肾病（IgA nephropathy）是1968年由Berger和Hinglais首先提出,故又称Berger病,其临床表现以血尿最为常见。目前认为IgA肾病在世界各地都是原发性肾小球肾炎中最常见的类型,在我国约占所有原发性肾小球疾病的26%～34%,研究发现,在确诊后5～25年内,约20%～40%的患者不可逆地进展为终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）。成人IgA肾病的病理特点多以系膜基质的沉积、新月体的形成和间质损害更为严重,儿童IgA肾病的病理改变则常以系膜细胞的增殖为主,小管及间质病变较轻,即儿童临床表现多为轻重不等的血尿和蛋白尿,成人则常伴有肾功能的损害。目前IgA肾病的发病机制尚不清楚。大量文献资料多根据IgA肾病系膜区存在免疫复合物沉积而从其免疫学方面阐述,根据其系膜细胞增殖这一病理学特点研究的文献甚为少见。细胞外信号调节激酶（ extracellular signal-regulated MAP kinase,ERK）也称为p42P44 MAPK,是目前最为活跃的研究领域,Ras-raf-MEK-ERK1/2是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen–activated protein kinase,MAPK）家族最为经典的信号转导通路之一。当ERK1/2受到刺激时,激活下游特定的即早基因（immediate early genes,IEG）,其基因产物引起细胞的生物学变化。已经证明MAPK尤其是ERK1/2表达的改变高度影响系膜细胞的增殖,但ERK1/2是否参与IgA肾病的发病目前尚未见报道。本实验通过建立IgA肾病模型,并给予大鼠口服雷帕霉素建立对照,从分子生物学角度观察ERK1/2在IgA肾病大鼠肾脏系膜细胞的表达,了解IgA肾病发病的特点,从而揭示其发病机制。大量文献资料表明目前IgA肾病的治疗多选用大剂量糖皮质激素、鱼油、ACEI、ARB类药物和免疫抑制剂如环孢素A、环磷酰胺等来抑制免疫复合物的沉积,但尚无统一的治疗标准。雷帕霉素（rapamycin,RAP）是20世纪70年代初,由加拿大Ayerst研究所从放线菌培养液中分离出来的大环内酯类抗生素,20世纪70年代末期,Martal等首先发现其具有免疫抑制作用。业已证明雷帕霉素可通过不同的细胞因子受体阻断信号转导,抑制系膜细胞的增生,干扰细胞周期蛋白产物的表达和细胞周期依赖性激酶,因为雷帕霉素不仅具有免疫抑制作用,还具有高效低毒的特点,故目前广泛应用于肿瘤、器官移植等治疗,国内外罕见雷帕霉素应用于IgA肾病治疗的报道。本实验通过多种实验方法了解雷帕霉素对IgA肾病病理变化的影响,为揭示其分子生物学发病机制提供佐证,同时为临床应用新药提供实验室依据。方法1动物与药品Wistar雄性大鼠45只,体重80～100g,由河北省实验动物中心提供（实验动物质量合格证编号:702022）;雷帕霉素由华北制药惠赠;二步免疫组化试剂盒购于北京中杉有限公司;其他实验药品由河北医科大学病理教研室提供。2模型制备及实验分组2.1 IgA肾病模型的制备:隔日给予大鼠牛血清白蛋白按400mg·kg-1·d-1的剂量灌胃,持续6周,皮下注射蓖麻油0.5ml和四氯化碳0.1ml,每周一次,持续9周,脂多糖0.05mg分别于第6、8周尾静脉注射,观察至10周末。将肾皮质组织切成3μm的冰冻切片,采用兔抗大鼠IgA和FITC标记羊抗兔IgG间接免疫荧光染色,荧光显微镜下观察肾小球系膜区IgA沉积阳性,PASM和Masson染色显示系膜细胞增生和系膜基质的沉积表明造模成功（Fig.1）,成功率为90%。未建模成功的大鼠由相同条件的大鼠以同样方法建模直至成功。2.2实验分组Wistar雄性大鼠45只,体重80～100g,随机分为对照组（15只）、IgA肾病组（15只）和雷帕霉素治疗组（以下简称RAP组,15只）。IgA肾病组大鼠按上述方法建立模型。将RAP组大鼠按同样的方法成功建立IgA肾病模型后,继续给予雷帕霉素1mg·kg-1·d-1灌胃,观察至14周末。IgA肾病组大鼠在相同时间内自由饮水、进食。对照组在相同时间（14周内）给予相同剂量的生理盐水灌胃,观察至14周末。3各组大鼠生化指标的检测各组大鼠成功建立模型后准备处死,处死前用代谢笼收集其24小时尿液,用自动生化分析仪检测24小时尿蛋白;股动脉放血应用同样的方法测定BUN、Scr,将数据收集进行统计学分析。4 ERK1/2蛋白和cDNA的检测4.1免疫组化法检测ERK1/2蛋白在各组大鼠肾脏中的定位表达成功建模后取各组大鼠部分肾组织置于4%多聚甲醛固定,经石蜡包埋、切片。所用载玻片均经多聚赖氨酸处理,连续切片厚3μm,一抗为兔抗ERK1/2多克隆抗体,二抗为PV9000二步法检测试剂复合体,以0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。采用PV9000通用二步法试剂盒检测,光镜观察,阳性部位呈棕黄色。设定阳性比率,并行统计学处理。4.2 Western blot检测大鼠肾组织ERK1/2蛋白的表达部分肾组织用眼科剪刀剪碎放入冰冷的研磨玻璃试管内,加入冰冷的裂解缓冲液裂解肾皮质,用研磨棒轻轻地研磨,冰浴静置1h,然后4℃、14000r/min离心25min,上清液即为所提取的蛋白溶液。将所提取蛋白质经考马斯亮蓝定量,应用Western blot检测肾组织ERK1/2蛋白的表达,经电泳、转膜后显影,对Western条带进行分析。4.3半定量RT-PCR检测肾组织ERK1/2 cDNA的表达取各组大鼠部分肾组织,将其切割成大小约3×3mm的标本,分装,液氮中保存,每次实验取各组5个标本,加入Trizol研磨,提取ERK1/2 mRNA,将其反转录并扩增,统计cDNA的含量。结果1尿液及血清学结果显示,IgA肾病组大鼠的24hUPO、BUN、Scr均高于RAP组（P﹤0.001）和对照组（P﹤0.05）,同时RAP组大鼠的24hUPO、BUN、Scr也高于对照组（P﹤0.05,Table.1）。2免疫组化法检测ERK1/2蛋白在大鼠肾脏组织的沉积结果显示IgA肾病组较对照组（t=2.145,P﹤0.05）、RAP组（t=6.45,P﹤0.001）均明显升高,同时RAP组中ERK1/2的表达也高于对照组（P﹤0.05,Fig.2,Table.2）。3 Western blot和半定量RT-PCR检测结果显示IgA肾病组大鼠肾组织中ERK1/2蛋白和cDNA的表达含量高于对照组（P﹤0.05）和RAP组（t=67.39,P﹤0.001）,RAP组中ERK1/2蛋白和cDNA的表达含量同样也高于对照组（t=2.45,P﹤0.05,Fig.3、4,Table.3、4）。结论1 IgA肾病大鼠肾组织系膜细胞的细胞外信号调节激酶（ERK1/2）表达明显升高,同时RAP组大鼠肾组织中ERK1/2的表达亦较对照组明显上调,表明多种因素可激活ERK1/2信号转导途径,且可能由于该途径的激活而参与了IgA肾病的发病过程。2 ERK1/2信号转导途径激活使自身磷酸化,其蛋白及cDNA的表达增加,加入雷帕霉素治疗后能够明显抑制IgA肾病大鼠肾组织中ERK1/2蛋白和cDNA的表达,提示雷帕霉素具有治疗实验性IgA肾病大鼠的作用,但RAP组中ERK1/2的表达较对照组仍高,故是否能使大鼠IgA肾病得到彻底缓解尚需进一步研究,同时需要反复实验找到雷帕霉素治愈IgA肾病的合适剂量。3 ERK1/2信号转导抑制剂可能成为临床治疗IgA肾病的新途径。