目的：　　由于多重耐药菌株的广泛散播及临床治疗困难，氯霉素再次出现在人们的视野。氯霉素的衍生物氟苯尼考也广泛应用于畜牧业及水产养殖业。floR基因主要介导对氯霉素及氟苯尼考的外排且广泛存在于临床肠杆菌科细菌中。本文通过重组PCR、基因克隆、MIC测定及SNPs分析对不同结构floR基因耐药性差异进行分析。筛选floR基因阳性的肺炎克雷伯菌测定氟苯尼考MIC值，挑选MIC最高者作为实验菌株测定其在药物胁迫下生长曲线、选择不同生长点收集细菌测定转录组，初步分析转录组信息。　　方法：　　1.本课题从温州医科大学附属第一医院收集致病株作为实验菌株来源，共九个种属病原菌，其中鲍曼不动杆菌(ABA)238株，肺炎克雷伯菌(KPN)240株，大肠埃希菌(ECO)200株，铜绿假单胞菌(PAE)239株，沙门菌属(SAL)201株，阴沟肠杆菌(ECL)238株，金黄色葡萄球菌(SAU)233株，屎肠球菌(EFM)231株，粪肠球菌(EFA)240株。采用SDS法提取细菌基因组DNA，送交中科院北京基因组研究所进行solexa测序。　　2.将九个样本测序所得到的短序列进行拼接和注释，从GenBank数据库和ARDB中收集到的氯霉素耐药基因作为参考序列，对测序读长进行mapping，得到各基因在不同种属菌株菌株测序序列中的丰度。　　3.选取其中坳oR为代表基因，设计特异性引物，克隆并测序鉴定，测定成功克隆株的MIC值并分析floR基因的多态性。　　4.为了研究不同菌株来源的floR基因MIC值的差异是由启动的强弱引起还是由于ORF中关键位点的突变引起，我们选取MIC值最高的一株作为假想强启动子P1的PCR模板，选MIC值较低的一株作为假想弱启动子P2的PCR模板，选取对氯霉素MIC不同的17株菌作为ORF的PCR模板，P1，P2分别同17个ORF进行重组PCR。　　5.通过重组PCR将P1，P2分别与17株菌的floR基因的ORF进行连接。重组片段纯化后进行克隆，共获得30个克隆株，并进行测序验证序列正确。琼脂稀释法测定30个克隆株的MIC值，分析MIC值及其与DNA序列结构变化的关系。　　6.通过PCR对327株肺炎克雷伯菌进行floR基因的筛选，选取对氟苯尼考耐药性最高的一株作为实验菌株，测定其在氟苯尼考胁迫下的生长曲线，并收集潜伏期，对数早期，对数中期的细菌，进行转录组测序。　　结果：　　1.氯霉素耐药基因丰度图中可以看出在九种细菌中不同程度的存在氯霉素和（或）氟苯尼考耐药基因，其中floR基因存在于六种细菌中而pexA基因则存在于这九种细菌中，这两个基因型在相应的细菌中的平均丰度和覆盖度都较高。　　2.以混合基因组为模板进行PCR获得的110个克隆株，测定MIC值并与对照株FloR-21-T的MIC值相比，各菌株之间的MIC值存在较大的差异，有些甚至对氯霉素及氟苯尼考无耐药性。　　3.含有启动子P1的基因重组克隆株与相应原始克隆株相比其氯霉素及氟苯尼考的MIC有不同程度的提高，含有启动子P2的基因重组克隆株与相应原始克隆株相比其MIC值没有明显的变化。　　4.对floR基因产物FloR蛋白结构进行预测，显示其具有12个跨膜螺旋区，与经典的MFS蛋白具有相似的结构。将包含P1，P2共30个克隆株的SNPs位点进行统计，共包含47个突变位点，其中有26个为非同义突变位点，16个同义突变和4个无义突变。在26个非同义突变位点中有16个突变位点是位于FloR蛋白的跨膜区内。　　5.应用生物信息学工具对转录组测序数据进行整理，统计不同生长点的基因转录水平差异。　　结论：　　1.新一代的高通量测序技术非常适合分析多重耐药细菌耐药基因的分布情况及遗传变异规律。该技术不仅可以准确地获得耐药基因在临床细菌中的分布情况，而且有助于新的耐药基因的发现，也为研究耐药基因的传播途径提供一定的理论基础。　　2.通过对含P1，P2克隆株的MIC进行比较发现含P1基因重组克隆株MIC值有不同程度的提高，说明P1可能为强启动子，在调节floR基因的高表达中可能发挥重要作用。　　3.通过对MIC及SNPs的分析，含P1，P2共30个重组克隆株中有16个突变位点位于FloR蛋白的跨膜区内，结合药敏结果与SNP分析我们推测floR基因ORF区域position:85，197，284，562可能影响该基因对氯霉素类抗生素的耐药性。　　4.转录组测序数据初步分析，可能有四个orf与氟苯尼考的耐药性相关，orf_1的表达在加药后的各个时期比空白对照均有大幅度的上升，氟苯尼考的存在刺激该基因的高表达。