研究背景:糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）是胰岛素分泌绝对或相对不足,并以高血糖、高血脂为特征的代谢紊乱综合征。炎症在许多代谢性疾病的进展中起着关键作用。糖尿病呈一种低度全身性炎症状态,表现为炎症因子产生异常和炎症信号通路的激活。糖尿病早期高血糖引起的炎性应激可导致交感神经兴奋,交感神经兴奋可加重炎性反应。外周神经节内,神经节神经元的胞体由卫星胶质细胞（Satellite glial cells,SGC）围绕包裹。神经元与卫星胶质细胞关系密切。嘌呤能信号参与神经元-胶质细胞双向通信。P2Y12受体属于G蛋白偶联受体家族,P2Y12受体内源性激动剂ADP、ATP可激活P2Y12受体。P2Y12受体涉及周围神经损伤及感觉功能异常。表达于卫星胶质细胞的P2Y12受体参与神经病理痛的病理变化。在神经病理痛模型中,基因敲除P2Y12受体或选择性P2Y12受体拮抗剂可抑制炎性细胞因子的产生,缓解炎性病变和模型动物神经病理性痛行为。研究表明,交感神经去神经可明显改善胰岛素敏感性和糖代谢,交感神经活动可能和糖尿病及其并发症密切相关。腹腔神经节（celiac ganglion,CG）是椎前交感神经节,其神经节后纤维投射到肝脏,影响肝脏的功能。肝脏是人体的代谢中心,在调节糖原合成和脂质代谢等方面发挥重要的作用。交感神经兴奋可导致肝糖原合成减少,血糖水平升高。目前,研究人员还没有明确表明上调的P2Y12受体是否影响腹腔交感神经节和肝脏并参与糖尿病的发病机制。糖尿病心脏自主神经病变（Diabetic cardiac autonomic neuropathy,DCAN）是2型糖尿病的常见并发症,主要指支配心脏和血管的自主神经纤维因慢性高血糖而受损和丢失的情况,可导致心血管异常和心血管危重症风险增加。颈胸交感星状神经节（stellate ganglion,SG）主要支配心脏,其神经纤维可分布至心神经丛影响心脏的活动。我们实验室的前期研究观察到星状神经节中的P2Y12参与了糖尿病心脏自主神经病变的过程,但P2Y12在糖尿病引起颈部交感神经节损伤诱发心交感神经病变的详细作用机理尚不清楚。CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODN）是合成的短单链DNA分子,可激活TLR9受体,发挥强大的免疫刺激作用。CpG ODN已被证明具有心脏保护和细胞保护作用。但尚不知CpG ODN是否在DCAN中发挥保护作用,以及这种有益的保护是否涉及对P2Y12介导的心脏交感神经损伤的调节。肾素-血管紧张素系统（Renin angiotensin systems,RAS）的功能失调在糖尿病慢性并发症的发生发展中发挥着重要作用。RAS是机体内重要的内分泌调节系统,由经典的血管紧张素转化酶（Angiotensin converting enzyme,ACE）-血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）-血管紧张素Ⅱ受体1（Angiotensin type l receptor,AT1R）和非经典的血管紧张素转化酶2（Angiotensin converting enzyme 2,ACE2）-血管紧张素1-7（Angiotensin 1-7,Ang 1-7）-Mas受体2条轴组成,具有调节电解质平衡、维持心血管稳态等生理功能。越来越多的研究表明,RAS不仅存在于体液系统,也存在于神经系统中。自主神经系统中的血管紧张素能神经传递是许多常见心血管疾病治疗干预的潜在新靶点。现已确定,SG拥有自己的RAS。然而,在DCAN背景下,SG中RAS发挥怎样的调节的作用以及与嘌呤能P2Y12受体是否存在相互作用尚不清楚。目的:1、探讨P2Y12受体对2型糖尿病大鼠腹腔神经节交感系统调节肝脏代谢的作用,重点关注嘌呤能P2Y12受体对肝葡萄糖激酶（Glucokinase,GK）功能的影响。2、通过实验研究CpG ODN 1826对SG中P2Y12受体介导的心脏交感神经病理变化的作用及机理。3、观察心交感神经损伤过程中SG中AngⅡ/AT1R轴和ACE2/Ang1-7轴的变化,探讨RAS在心脏自主神经系统稳态调节中的作用,并观察短发夹RNA（Short hairpin RNA,shRNA）靶向P2Y12对DCAN中RAS两条轴的影响。方法:1、通过高糖高脂喂养配合小剂量链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）注射构建2型糖尿病（T2DM）大鼠模型,通过尾静脉注射P2Y12 shRNA/P2Y12拮抗剂替格瑞洛。分别监测各组大鼠腹腔交感神经放电（Sympathetic nerve discharge,SND）活动;检测各组大鼠空腹血糖、胰岛素水平、肝糖原含量、血脂水平;实时定量荧光PCR（Quantitative Real-time PCR,q-PCR）和蛋白印迹（Western blotting,WB）法检测大鼠腹腔神经节和肝脏中P2Y12 mRNA和蛋白表达;q-PCR检测肝脏GK、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋3（Nod-like receptor protein 3,NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated spot-like protein,ASC）、半胱氨酸蛋白酶1（caspase-1）和白介素-1β（IL-1β）mRNA的表达;蛋白印迹检测各组大鼠肝脏GK、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β蛋白表达变化以及NF-κB p65表达水平。2、建立2型糖尿病大鼠模型,通过腹腔注射CpG ODN 1826。分别检测各组大鼠空腹血糖、胰岛素水平、血脂水平;测量大鼠血压（BP）、心率（HR）、心率变异性（HRV）和交感神经放电活动;q-PCR检测各组大鼠SG中P2Y12、肿瘤坏死因子-α受体（TNF-α）、IL-1βmRNA的表达;蛋白印迹检测各组大鼠Toll样受体9（Toll-like receptor 9,TLR9）、P2Y12、TNF-α、IL-1β、核受体共激活剂4（Nuclear receptor coactivator 4,NCOA4）、谷胱甘肽过氧化酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）蛋白表达变化以及NF-κB p65磷酸化水平;试剂盒检测SG中ATP、组织铁、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）、谷胱甘肽（Glutathione,GSH）的水平;免疫荧光双标检测各组大鼠SG中TLR9受体与Neu N（神经元标志物）、P2Y12受体与GFAP（卫星胶质细胞激活标志物）的共表达水平;分子对接模拟CpG ODN 1826与P2Y12的结合;透射电子显微镜观察SG线粒体结构变化;培养PC12细胞,检测不同处理条件下细胞内cAMP水平。3、建立2型糖尿病大鼠模型,通过舌下静脉注射P2Y12shRNA质粒。分别检测各组大鼠空腹血糖、胰岛素水平;测量大鼠血压（BP）、心率（HR）、心率变异性（HRV）和交感神经放电活动;q-PCR检测各组大鼠SG中P2Y12、TNF-α、IL-1βmRNA的表达;蛋白印迹检测各组大鼠P2Y12、TNF-α、IL-1β、AngⅡ、AT1R、ACE2、蛋白表达变化以及NF-κB p65磷酸化水平;试剂盒检测SG中AngⅡ、Ang1-7、ROS的水平;免疫荧光双标检测各组大鼠SG中AngⅡ受体与Neu N（神经元标志物）、P2Y12受体与GFAP（卫星胶质细胞激活标志物）的共表达水平。结果:1、研究发现,2型糖尿病大鼠腹腔神经节和肝脏中P2Y12受体的表达水平增加,同时出现腹腔交感神经放电的活性增强。此外,T2DM大鼠出现高血糖和血脂紊乱,肝葡萄糖激酶表达显著降低,同时肝糖原合成减少,而NLRP3、ASC、活性caspase-1、NF-κB和IL-1β水平升高。用靶向P2Y12的shRNA处理后,腹腔神经节和肝脏中P2Y12受体表达下调,但不影响正常大鼠P2Y12的表达,血糖和血脂异常得到明显改善,肝脏NLRP3、ASC、活性caspase-1和IL-1β水平明显下降。P2Y12 shRNA和替格瑞洛都可以提高肝葡萄糖激酶表达,促进肝糖原合成,降低NF-κB表达水平。2、研究结果表明,T2DM大鼠P2Y12 mRNA和蛋白表达升高,荧光双标结果显示T2DM大鼠SG中P2Y12和GFAP的共表达水平较高。分子对接结果显示CpG ODN 1826与P2Y12有较高的亲和性。cAMP水平检测显示,CpG ODN1826处理显著拮抗了ADP对Forskolin刺激的PC12细胞内cAMP水平的抑制作用。CpG ODN 1826处理显著降低了T2DM大鼠P2Y12表达以及在SG中与GFAP的共表达水平。CpG ODN 1826激活TLR9受体,改善了糖尿病大鼠血脂紊乱、异常的血压（BP）、心率（HR）、心率变异性（HRV）和交感神经放电（SND）活动,并降低SG中上调的磷酸化（p）-NF-κB、TNF-α和IL-1β表达,降低组织铁、ROS和MDA水平,升高了GPX4和GSH水平。此外,CpG ODN 1826有助于改善SG中线粒体结构的异常变化。3、研究结果表明,T2DM大鼠P2Y12mRNA和蛋白表达升高,免疫荧光双标结果显示,P2Y12和GFAP在T2DM大鼠星状神经节中高度共表达。P2Y12shRNA处理显著降低了P2Y12表达以及与GFAP的共表达水平。与对照大鼠比较,糖尿病大鼠血脂异常、血压（BP）和心率（HR）升高、心率变异性（HRV）降低、交感神经放电（SND）活动增加。此外,蛋白印迹结果显示T2DM大鼠AngⅡ、AT1R、TNF-α、IL-1β、p-NF-κB蛋白表达升高,ACE2蛋白表达下降,ELISA结果显示SG中AngⅡ水平升高,AngⅡ/Ang 1-7比值增加、ROS的水平上升。免疫荧光双标显示T2DM大鼠SG中AngⅡ受体与Neu N（神经元标志物）共表达水平升高。P2Y12 shRNA处理改善了T2DM大鼠异常的BP、HR、HRV和颈部SND活动,降低了Ang II/AT1R的过度激活,并增加ACE2/Ang 1-7的表达。此外,经P2Y12 shRNA处理,SG中TNF-α和IL-1β的表达水平、磷酸化NF-κB和ROS水平降低。结论:1、结果表明,shRNA对P2Y12的沉默可以有效地改善腹腔SND的异常活性,并通过降低肝细胞炎症和抑制可能由于激活的NLRP3炎症小体和caspase-1信号而导致的肝细胞焦亡,来改善功能失调的肝葡萄糖激酶,从而降低T2DM大鼠的高血糖。2、总体而言,CpG ODN 1826通过激活TLR9受体降低P2Y12相关的颈交感神经兴奋性和异常的神经元-胶质细胞信号传递,以实现心自主神经系统活动的平衡并缓解大鼠的DCAN。该机制可能涉及通过减少ATP释放和p-NF-κB表达来调节SG中P2Y12受体表达与激活,从而减轻SG中上调的P2Y12介导的交感神经炎症和铁死亡。3、P2Y12介导的DCAN与SG中Ang II/AT1R和ACE2/Ang 1-7信号传导失调有关。P2Y12 shRNA处理减少了P2Y12的过度表达,并改善了RAS中AngⅡ/AT1R和ACE2/Ang 1-7信号传导失衡,从而减轻了糖尿病大鼠心脏自主神经病变。