论文部分内容阅读
寄生蜂是最为丰富多样的昆虫种群之一，同时也是重要的生态调节因子和害虫天敌资源。寄生蜂有两种基本的寄生策略。内寄生蜂将卵产在寄主体内，而外寄生蜂则将卵产在寄主表面。蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum是蛹期内寄生蜂，可寄生包括重要农业害虫菜青虫Pieris rapae在内的多种蝶类。蝶蛹金小蜂是Pteromalinae亚科中一个相对近期从外寄生进化为内寄生的代表种。因而，通过与模式外寄生蜂丽蝇蛹集金小蜂Nasoniavitripennis的比较，蝶蛹金小蜂提供了研究内外寄生蜂差异和进化的良好系统。与丽蝇蛹集金小蜂类似，毒液是其寄生过程中主要的寄生因子，可调控寄主的免疫和代谢等系统，进而促进寄生蜂后代的发育。在本论文中，我们解析了蝶蛹金小蜂毒液蛋白的组成，并探索了其中两个毒液蛋白的功能和进化。 1.蝶蛹金小蜂基因组测序与分析 为了更好地获得信息背景用于进一步的毒液研究，我们对蝶蛹金小蜂基因组进行了测序和拼接。拼接所得的蝶蛹金小蜂基因组大小为338.1 Mb，其中contig N50为38.7 Kb，scaffold N50为1.16 Mb。在该基因组中,204个miRNA、140个rRNA、52个snRNA和20个snoRNA得到注释。同时，14946个蛋白编码基因得到注释，其中90％的基因拥有至少一个功能注释。进化分析结果显示，蝶蛹金小蜂与丽蝇蛹集金小蜂亲缘关系最近，他们之间的分化时间大约为30.0719个百万年。 2.蝶蛹金小蜂毒液蛋白组成分析 为了为寄生蜂后代营造更适宜的生存环境，内外寄生蜂均将毒液注入寄主，并调控寄主的免疫、代谢和发育等。采用转录组和蛋白质组结合的方法，我们在蝶蛹金小蜂毒液中鉴定到70个候选毒液蛋白，并对其中34个和8个毒液蛋白分别采用了实时定量PCR和western blot进行验证。较之与其他已报道的内寄生蜂毒液蛋白，这些毒液蛋白中的大部分与丽蝇蛹集金小蜂具有更高的序列相似度。另外，13个蝶蛹金小蜂毒液蛋白只与其他内寄生蜂毒液蛋白有相似性，而不能在丽蝇蛹集金小蜂毒液中被检测到。这些蛋白可能在蝶蛹金小蜂适应内寄生过程中起到一定作用。 3.蝶蛹金小蜂毒液Serpin剪接体的分析 为了确保成功寄生，寄生蜂将毒液注入寄主，以抑制黑化反应在内的寄主免疫系统。实验结果表明，蝶蛹金小蜂毒液可在体外抑制寄主血淋巴的黑化，并且该抑制作用具有剂量效应。采用基于活性追踪的分离纯化方法，我们在蝶蛹金小蜂毒液中鉴定到一个Serpin基因的剪接体蛋白，并命名为PpSVI。该毒液基因至少具有15个可变剪接形式。RT-PCR结果显示，该PpSVI毒液剪接体在毒腺中特异性高表达。重组表达的PpSVI蛋白也具有抑制寄主PPO（Prophenoloxidase，酚氧化酶原）通路激活的功能，但不能抑制已经激活的酚氧化酶(Phenoloxidase，PO)的活性。Pull down实验结果显示，PpSVI可与寄主的血淋巴蛋白形成SDS稳定的复合体。采用LC-MS/MS质谱鉴定，莱青虫血淋巴蛋白酶PrHP8和PrP AP1分别在与复合体中被鉴定到。另，复合体中PrHP8和PrP AP1的存在进一步被western blot所确证。 4.蝶蛹金小蜂毒液犬尿氨酸转氨酶(Kynurenine aminotransferase，KAT)的分析 为了确保成功寄生，寄生蜂毒液还常被用以调控寄主的细胞免疫。前期结果显示，蝶蛹金小蜂毒液可以诱导其寄主血细胞和一些昆虫细胞系的死亡。通过基于活性追踪的分离纯化方法，一个犬尿氨酸转氨酶在其毒液中被鉴定到，可能起到诱导受害细胞死亡的作用。通过对多种昆虫全基因组的注释，发现犬尿氨酸代谢途径中的Indoleamine indoleamine(IDO)和3-hydroxyanthranilate3，4-dioxygenase(HAAO)基因已经在昆虫中丢失，从而丧失了从头合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）的能力。因此，该毒液犬尿氨酸转氨酶并不是通过抑制NAD合成来诱导细胞死亡，其作用机理有待进一步研究。同时，该犬尿氨酸转氨酶基因家族在蝶蛹金小蜂和丽蝇蛹集金小蜂基因组中曾发生过大量的基因复制。进化树结果暗示，该毒液基因可能源自于非毒液基因的复制事件，其在复制过程中获得了信号肽，并最终被招募为毒液蛋白。 在本论文中，我们测序组装了蝶蛹金小蜂的基因组序列，同时也利用转录组和蛋白质组的方法，解析了蝶蛹金小蜂的毒液蛋白组成。基于活性追踪的分离纯化，我们从中鉴定到一个毒液Serpin可变剪接体，可抑制寄主血淋巴的PPO激活，还鉴定到一个犬尿氨酸转氨酶可能参与诱导寄主血细胞的死亡。结合基因组序列信息，我们进一步对这两个毒液蛋白的进化来源进行了分析。其中，毒液Serpin剪接体可能是通过可变剪接的形式被招募至毒液，而犬尿氨酸转氨酶则可能通过基因复制最终进化成毒液蛋白。这些结果部分揭示了寄生蜂毒液抑制寄主免疫的机理，也为寄生蜂毒液蛋白进化提供了新的见解，同时也为今后更详尽地解析蝶蛹金小蜂毒液蛋白功能和进化提供了坚实的背景信息。