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研究背景宫颈癌是女性生殖系统十分常见的恶性肿瘤,其主要病因是高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染,HPV编码的癌蛋白E6/E7是导致宫颈细胞恶性转化的关键蛋白。放射治疗是中晚期宫颈癌的重要治疗方法,放疗后复发仍然是宫颈癌患者治疗中的主要问题,研究其分子机制是解决肿瘤细胞放射耐受的关键。有研究表明HPV阳性的细胞系SiHa、HeLa比HPV阴性细胞系C33A对放射更耐受,研究HPV在宫颈癌放疗中的作用能为更好的治疗宫颈癌提供新思路和靶标。小GTP酶蛋白Rab属于Ras蛋白超家族的一员,很多癌症中存在Rab的异常表达。Rab12与分布在胞质中的小囊泡相关联,它可能加速囊泡从细胞边缘到核周中心体区域转运,也可以通过控制循环内体到溶酶体的载体运输这一途径,间接地刺激自噬。DENND3是Rab12的上游分子,RILP-L1、RILP是Rab12的效应分子。放射可诱导细胞发生自噬,自噬可能作为细胞保护机制,通过清除异常蛋白质和缺陷细胞器保持营养和能量的体内平衡。我们前期实验发现HPV编码的早期癌蛋白E6与E7可上调Rab12的表达,Rab12是否对HPV阳性宫颈癌细胞放射耐受起作用有待研究。研究目的研究Rab12对宫颈癌放射敏感性的影响及其机制。研究方法与结果1.HPV早期癌蛋白E6/E7影响Rab12的表达利用逆转录病毒包装系统获得含质粒pBabe-Vector、HPV16E6和HPV16E7的病毒颗粒,感染细胞并用嘌呤霉素筛选获得稳定表达E6/E7的细胞系,Western blot检测发现E6/E7可上调Rab12的表达。在宫颈癌SiHa、Caski细胞(HPV16阳性的宫颈癌细胞)中干扰16E6/E7,在HeLa细胞(HPV18阳性的宫颈癌细胞)中干扰18E6/E7,Western blot检测发现干扰E6/E7后Rab12的表达降低。2.射线对细胞中Rab12表达的影响Western blot 检测不同细胞系 SiHa、HeLa、C33A、HaCaT 放射前后 Rab12的表达量。进一步检测SiHa细胞放射后不同时间,以及不同放射剂量梯度下Rab12的表达。发现放射可促进Rabl2表达。3.Rab12与宫颈癌放疗敏感性的研究SiHa细胞分为NC组与干扰Rab12组,C33A细胞(HPV阴性的宫颈癌细胞)分为NC组与过表达Rab12组,分别照射不同剂量梯度的的X射线,通过克隆形成实验、绘制生存率曲线、CCK-8实验检测射线对不同处理组细胞生长增殖情况和活力的影响。在SiHa细胞干扰Rab12组,细胞增殖更慢,活力更低;在C33A细胞过表达Rab12组,细胞增殖更快,活力更高。这表明Rab12促进了宫颈癌细胞的放射抵抗。4.放射条件下宫颈癌细胞中Rab12与细胞凋亡的研究Western Blot检测放射组与化疗组处理后凋亡相关的蛋白PARP1、Cleaved-PARP1与Bcl-2的表达变化,结果显示放射后24h,SiHa细胞凋亡没有明显变化。而顺铂处理后24h可看到Bcl-2随药物剂量的增加而明显减少,PARP1也被剪切成Cleaved-PARP1。SiHa细胞在化疗药物顺铂诱导下的细胞凋亡可能是其主要死亡形式,而SiHa细胞对放疗的反应中,细胞凋亡途径起到的作用相对较小,Rab12影响宫颈癌放疗敏感性并不是通过影响相关的细胞凋亡途径。5.Rab12对宫颈癌细胞自噬的影响干扰Rab12与无血清饥饿诱导自噬,Western Blot检测自噬相关指标p62、Beclin1、LC3B,结果表明人宫颈癌细胞中Rab12与细胞自噬有关。SiHa细胞分为NC组与干扰Rab12组,Western Blot检测不同梯度剂量照射下以及照射后不同梯度时间下的自噬相关指标p62、Beclin1、LC3B,结果表明干扰Rab12可逆转放射引起的自噬升高。6.Rab12对宫颈癌细胞放射后细胞周期的影响流式细胞术检测放射、顺铂、博来霉素处理24h后SiHa细胞干扰Rab12组与NC组细胞周期变化,检测放射后C33A细胞Rab12组与NC组。干扰Rab12和过表达Rab12不改变正常生长状态下细胞的细胞周期,但是可以影响放射或药物损伤后细胞周期的分布。结论本研究首次证实了 HPV早期癌蛋白E6、E7可上调Rab12的表达,过表达Rab12后的宫颈癌细胞生长增殖加快,提示Rab12可能与肿瘤的恶性程度相关。Rab12参与调节HPV阳性宫颈癌细胞的放射耐受,其作用主要是通过促进细胞保护性自噬,调控细胞周期来实现的。