菌膜诱发的细菌耐药性已成为人类健康和安全的重大威胁。纳米抗菌材料因其有别于抗生素的作用机理（例如,机械破坏和氧化损伤等）引起广泛的关注,在生物医学和生产中展示了广阔的应用前景。目前,纳米抗菌材料与菌膜相互作用的研究主要聚焦于发展高效抑制菌膜生长和破坏成熟菌膜的抗菌策略。而对于纳米抗菌材料如何影响菌膜中细菌之间的组装模式（比如彼此间的距离和作用模式等）进而达到抗菌膜效果,尚未可知。为了解答这个问题,本工作构建了一种由激光共聚焦显微成像技术和3D数据建模相结合的单细胞分析平台,能够实时动态、单细胞分辨率下分析菌膜行为,并将其用于分析抗菌碳纳米管对菌膜结构转变的影响。主要研究内容和成果概述如下:1、构建单细胞水平分析菌膜结构的方法我们选择铜绿假单胞菌为实验模式菌株,通过菌膜生长动力学实验和整体菌膜结构的激光共聚焦显微成像观察,选择生长4 h的菌膜结构作为单细胞分析的生物模型。菌膜培养于圆玻片,菌膜细菌用绿色荧光染料SYTO9进行荧光标记。优化激光共聚焦显微成像条件,我们确定以z轴步长为0.4μm,zoom值为2.5对菌膜进行3D成像。然后,利用Matlab和Biofilm Q等数据处理软件对菌膜3D图进行预处理和分割,通过计算细菌相关参数,得到菌膜的3D建模和量化数据。结果显示,培养4 h的铜绿假单胞菌菌膜中含有大约550个细菌,临近细菌的距离为1.1μm,局部菌膜厚度为7.0μm,实现了菌膜内单细菌行为及组织结构的观察和分析。2、宏观上探究碳纳米管对菌膜的影响我们采用羧基化的方法合成带负电的多壁碳纳米管（MCNT）,然后通过共价接枝的方法合成多壁碳纳米管接枝聚乙烯亚胺（MCNT-PEI）。透射电子显微镜（TEM）、Zata电位和稳定性实验证明了MCNT和MCNT-PEI的成功制备,且具有良好的分散性和稳定性。随后,我们研究了碳纳米材料的抗菌性,测得MCNT和MCNT-PEI都具有很强的杀菌能力,且抗菌性呈浓度依赖性。同时,我们发现两种碳纳米管均会影响菌膜生长动力学,促使菌膜的成熟期提前;而且,MCNT会导致菌膜成熟期最大生物量的降低,而MCNT-PEI却不会影响菌膜的最大生物量。3、单细胞水平分析碳纳米管对初期菌膜结构的影响基于单细胞水平分析平台,我们研究了碳纳米管对初期菌膜结构转变的影响。菌膜生长初期可以划分为2个阶段:浮游细菌的附着,以及细菌增殖和分泌EPS,形成小菌落,菌膜结构由二维延展转向为三维生长。结果显示,MCNT和MCNT-PEI会改变菌膜细菌的增殖期,主要表现在菌膜里的细菌数量、菌膜体积和菌膜粘附基底的面积均显著降低。与正常菌膜相比,MCNT组和MCNT-PEI组的菌膜中细菌数目分别减少约340和321个,菌膜体积分别降低334μm~3和352μm~3。MCNT组和MCNT-PEI组菌膜粘附基底的面积分别从正常组的51.1μm~2降低到38.7μm~2和32.1μm~2。此外,MCNT和MCNT-PEI会影响菌膜从二维到三维的转变,主要表现在菌膜纵横比（菌膜的高/菌膜的长）和细胞间距离（菌膜里单个细菌到它周围最近细菌的距离的平均值）的降低,临近细胞密度（细菌临近3个分割单元的范围内的细菌数量）的升高。另外,我们利用平板计数和结晶紫染色等经典方法分析碳纳米材料对初期菌膜的影响,发现两种碳纳米管均降低了菌膜的细菌数目和生物量,与微观数据趋势一致。同时,我们通过荧光成像和定量分析,以及硫酸-苯酚法对菌膜中多糖含量进行测定,结果显示,碳纳米管会显著促使细菌分泌多糖,猜测其可能通过激活细菌的应激保护机制影响菌膜结构。综上所述,本工作成功构建了菌膜结构的单细胞水平分析平台,并将其用于研究碳纳米管对初期菌膜结构转变的影响。结果表明,碳纳米管通过影响菌膜细菌的增殖,以及菌膜从二维到三维的生长过程,进而影响初期菌膜结构。直观、定量分析抗菌纳米材料对细菌从个体到群体转变的影响,对于深入理解纳米材料与细菌行为之间的作用模式具有重要意义,而且可为设计新型抗菌材料提供理论指导。