丝状真菌具有卓越的表达和分泌能力，以及与哺乳动物相似的糖基化修饰系统，其安全性也广泛为人们所接受，是表达真核基因的理想系统。目前，在世界范围内研究和开发丝状真菌表达系统已成为重组酶制剂研究领域的热点。尽管目前国内利用木霉、曲霉发酵生产木聚糖酶已经达到了很高的生产水平，但是距离国际先进水平还有一定差距。同时，生产的木聚糖酶并不能满足一些特殊需要。例如，由于具有较高的木糖苷酶活性，这些木聚糖酶并不适用于低聚木糖的生产。通过基因工程手段表达内切木聚糖酶是解决这一问题的有效途径。　　 本实验以糖化酶生产菌黑曲霉CICC2462为受体菌，以高表达的糖化酶基因位点为基因整合的靶位点，构建β-1，4-内切木聚糖酶基因黑曲霉表达载体，采用农杆菌介导法对黑曲霉进行遗传转化，并通过在潮霉素基因表达框两侧设计顺向重复序列，使其在转化子后代中删除潮霉素筛选标记基因，获得食品级工程菌。　　 取得的主要研究结果如下:　　 1.基因与同源臂的克隆采用PCR扩增方法，分别获得木聚糖酶基因xyn2和xynB，黑曲霉糖化酶基因的上游片段5GLA和下游片段3GLA。　　 2.黑曲霉表达载体的构建采用重叠延伸PCR技术，将5GLA、xyn2或xynB、3GLA片段进行拼接，得到同源重组表达框G2G或GBG，将其与黑曲霉表达载体pSZH连接，构建木聚糖酶黑曲霉表达载体pSZH-xyn2和pSZH-xynB。　　 3.农杆菌介导法转化黑曲霉及转化子的筛选采用冻融法将黑曲霉表达载体pSZH-xyn2和pSZH-xynB转化入农杆菌AGL1中，农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462。经PCR鉴定，xyn2基因转化的阳性率为34.78％，xynB基因转化的阳性率为70.15％。　　 4.xynB基因同源重组转化子的筛选用同源重组引物对12株阳性菌株做PCR鉴定，结果有9株可扩增出约1701bp的目的条带，是同源重组转化子，pSZH-xynB转化的同源重组率为75％。在含200mmol/L潮霉素B的PDA液体培养基中连续传代5代后，将液体培养物涂在含有200mmol/L潮霉素B的PDA固体培养基上。挑取26个单菌落做PCR鉴定，均为纯合的同源重组菌株。　　 5.xynB基因同源重组菌株中hph基因的删除将纯合的同源重组转化子B10-5在不含潮霉素B的PDA液体培养基中连续传代5代后涂布于不含潮霉素B的PDA平板上，从其上挑取了534个菌落于含200mmol/L潮霉素B的PDA平板上，结果有2个菌落未生长。提取这2个菌落的基因组DNA，分别用糖化酶基因引物和同源重组引物进行PCR鉴定，可扩增出约3000bp的目的条带，而不能扩增出1701bp的目的带，说明这两个菌落中的目的基因xynB仍整合在糖化酶基因位点，而与其连锁的潮霉素基因已经被删除，潮霉素基因的消除效率0.3745％。该实验结果也说明经多次传代后目的基因的遗传稳定性为100％。　　 6.重组菌株发酵条件的优化在纯合同源重组菌株中，糖化酶基因已经被木聚糖酶基因所置换，失去了对液化淀粉的利用能力，因此对糖化酶摇瓶发酵条件进行了优化。结果显示，当培养基配方为每升含100g葡萄糖、40g淀粉、20mL玉米浆、20g豆饼粉，pH5.5～6.0时，同源重组菌株表达水平较高，其酶活为4495.8975u/mL。　　 本文研究结果为生产低木糖苷酶活性的内切木聚糖酶提供了新的途径，为安全高效地生产酶制剂和重组蛋白提供了新的表达系统。