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该研究根据GenBank中登录的鸡Ii基因序列和载体pcDNA3的多克隆酶切位点设计一对引物,利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从经过有丝分裂原刀豆蛋白A(ConA)刺激16h活化的鸡脾淋巴细胞中扩增出大小约为672bp的基因;经单酶切鉴定,与已知的鸡Ii基因含有相同的Pst Ⅰ酶切位点.将其克隆到载体pcDNA3中,并转化宿主菌DH5 α,双酶切方法鉴定重组质粒pcDNA3-Ii.进一步测定重组质粒pcDNA3-Ii中鸡Ii基因的核苷酸序列,结果表明该基因完整开放阅读框架(Open reading frame,ORF)由672个核苷酸组成,编码223个氨基酸,与已知鸡Ii基因序列相比有98％的同源性,证明该实验成功的克隆到鸡Ii基因.根据所克隆的鸡Ii基因序列和原核表达载体PGEX-4T-1多克隆酶切位点设计另一对引物,应用PCR技术从重组质粒pcDNA3-Ii中扩增出含有完整ORF的鸡Ii基因.再将扩增的鸡Ii基因克隆到原核表达载体PGEX-4T-1中,构建原核表达重组质粒PGEX-4T-l-Ii,并进行双酶切鉴定.然后将该重组质粒转化大肠杆菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于37℃诱导培养4h,表达出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与Ii的融合蛋白GST-Ii.通过优化原核表达条件,确定了原核表达的最佳诱导时间和诱导剂浓度.对表达蛋白的可溶性进行鉴定,结果表明表达产物GST-Ii融合蛋白以包涵体形式存在.我们用优化的原核表达条件对含有PGEX-4T-1-Ii质粒的BL21菌进行大量诱导表达,反复冻融和超声方法裂解诱导菌,获得浓度较高的GST-Ii包涵体蛋白,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,溶解的包涵体通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析获得纯化的GST-Ii融合蛋白.利用纯化的GST-Ii融合蛋白作为抗原分别免疫家兔和小鼠制备兔抗鸡Ii多克隆抗体和鼠抗鸡Ii多克隆抗体.琼脂扩散实验表明制备的两种多抗均具有良好的反应性,ELISA实验表明兔多抗和鼠多抗的有效稀释度分别可达1:25600和l:64000,免疫荧光抗体实验证实鼠抗鸡Ii多抗能与鸡外周血淋巴细胞中的Ii蛋白反应,表明该多抗的特异性较强.综上所述,该研究成功地克隆了鸡Ii基因,并进行了原核表达和纯化了表达产物Ii蛋白,制备了效价高、反应性和特异性强的兔源和鼠源抗鸡Ii多克隆抗体,这些为进一步研究鸡Ii免疫学功能及其应用提供了试验材料.