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猪圆环病毒2型（PCV2）是猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的主要病原,可引起感染猪淋巴细胞的损害而导致机体免疫抑制,继发和混合多种病原的感染,诱发多种感染和疾病的发生,严重损害猪的健康和影响养猪业发展。PCV2为DNA病毒,基因组由17661768个核苷酸组成,基因组结构为闭合的环状单股负链DNA。对PCV2致病机理阐明是更好防控病毒感染和疾病发生的基础,对病毒编码蛋白的功能解析是研究其致病机理的重要方面。在PCV2基因组中存在多个开放阅读框（ORF）,编码产物在病毒感染和致病中发挥一定的作用。目前已经鉴定的有6个ORFs,对其编码蛋白在PCV2感染中的作用进行了研究,ORF5为本研究团队鉴定的一个新的编码PCV2非结构蛋白的基因,研究发现ORF5蛋白可以影响细胞周期、诱导细胞内质网应激（ERS）、细胞自噬和促进病毒的复制。细胞ERS和自噬在病毒感染中具有重要作用,诱导细胞自噬的信号通路众多,其中内质网应激—细胞自噬是一条重要的调控通路。前期研究发现了ORF5蛋白可诱导宿主细胞ERS和自噬发生,阻断ERS后细胞自噬作用也被下调,推测ORF5蛋白诱导的细胞自噬和ERS的发生相关。对ORF5蛋白诱导细胞自噬的通路鉴定以及细胞自噬对PCV2复制影响的研究,将为ORF5蛋白诱导细胞自噬机制和在病毒感染中的作用研究提供新的资料。本研究以PK-15细胞为研究对象,开展了ORF5蛋白诱导细胞自噬主要通路的鉴定,对诱导的细胞自噬影响病毒复制作用进行了研究。本研究获得了以下结果:（1）ORF5蛋白诱导PK-15细胞自噬。将PCV2和PCV2?ORF5（ORF5基因突变株）病毒株分别感染PK-15细胞,以重组表达质粒pEGFP-ORF5转染PK-15细胞。通过激光共聚焦显微镜观察到ORF5蛋白的表达使细胞自噬标记蛋白LC3由分散状态转变为斑点聚集,提示细胞出现自噬;Western blot检测发现LC3Ⅱ蛋白的含量升高,说明LC3Ⅰ蛋白被切割为LC3Ⅱ蛋白,诱导了细胞自噬;用细胞内质网应激抑制剂（4-PBA）抑制内质网应激后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值下降,细胞中LC3蛋白荧光斑点减少,说明抑制内质网应激后细胞自噬作用被下调。研究结果说明ORF5蛋白诱导了PK-15细胞自噬,内质网应激是诱发细胞自噬的途径之一。（2）细胞自噬促进PCV2在PK-15细胞内的复制。通过绘制PCV2和PCV2?ORF5病毒株在PK-15细胞内的生长曲线,发现在病毒感染细胞48 h内PCV2?ORF5毒株的DNA拷贝数明显低于PCV2试验组（P<0.01）;同时PCV2?ORF5毒株感染细胞后Cyclin A在核酸和蛋白水平均被上调,提示ORF5蛋白使细胞周期延长,利于病毒复制;在PCV2感染的PK-15细胞再转染pEGFP-ORF5重组质粒,发现PCV2 Cap蛋白的mRNA和蛋白表达均增加,抑制内质网应激后Cap蛋白的mRNA和蛋白表达均出现下降。说明病毒和ORF5蛋白诱导的细胞自噬促进了PCV2复制。（3）ORF5蛋白通过PERK-eⅠF2α-ATF4和mTOR-ERK1/2-AMPK诱导PK-15细胞自噬。对转染pEGFP-ORF5重组质粒的PK-15细胞中PERK信号通路和mTOR信号通路管件接头蛋白进行检测。结果表明,ORF5蛋白上调了PERK蛋白的磷酸化水平,激活通路下游效应因子eⅠF2α/ATF4的表达,促进了LC3Ⅰ切割为LC3Ⅱ蛋白;通过加入通路抑制剂后,PERK蛋白的磷酸化、eⅠF2α和ATF4蛋白水平、LC3Ⅱ的含量均降低。表达ORF5蛋白的PK-15细胞的mTOR蛋白磷酸化被抑制,其通路下游ERK1/2-AMPK蛋白磷酸化水平升高,检测发现LC3Ⅱ蛋白的含量也升高,说明mTOR-ERK1/2-AMPK信号通路被活化和细胞自噬的发生;分别用U0126和Compound C试剂抑制细胞ERK1/2和AMPK蛋白磷酸化后,mTOR蛋白的磷酸化增加,LC3Ⅱ蛋白含量下降,细胞自噬被抑制。本研究结果表明,ORF5蛋白促进了PK-15细胞PERK-eⅠF2α-ATF4和mTOR-ERK1/2-AMPK信号通路的激活,诱导细胞自噬。（4）PERK-eⅠF2α-ATF4和mTOR-ERK1/2-AMPK信号通路的激活促进PCV2的复制。将重组质粒pEGFP-ORF5转染PK-15细胞,然后分别感染PCV2和PCV2?ORF5病毒株。研究发现ORF5蛋白使Cap蛋白的mRNA和蛋白表达均增加。加入通路抑制剂后,PERK、ERK1/2和AMPK的磷酸化被抑制,Cap蛋白的mRNA和蛋白表达下降,Rapa抑制mTOR的磷酸表达后促进了PCV2的复制。说明病毒和ORF5蛋白可以通过PERK-eⅠF2α-ATF4和mTOR-ERK1/2-AMPK通路促进PCV2复制。本研究结果表明,PCV2 ORF5蛋白主要通过激活PERK-eⅠF2α-ATF4和mTOR-ERK1/2-AMPK信号通路诱导PK-15细胞自噬,促进PCV2的复制。