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癌症(亦称恶性肿痛)是一种在全球范围内产生严重不良影响的疾病,每年造成数百万人死亡。目前为止,人类尚无治愈癌症的有效方法。寻找新型、高效和低毒的抗癌药物仍是当前面临的一项重大课题。生物活性多肽是一类由多个氨基酸通过肽键相连形成的化合物,具有调节人体多种生理功能如抗肿痛、提高免疫、抗病毒和降血压等作用。而且肽类物质的结构类型十分丰富,有巨大的药物活性筛选潜力。本文以珍贵传统中药材中华草龟肌肉蛋白为原料,以可控酶解技术为手段制备具有抗肿痛生物活性的多肽化合物。首先比较蛋白酶解法与微生物发酵法制备活性多肽的优缺点,酶解法所用蛋白酶为复合蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶,发酵法所用菌种为枯草芽孢杆菌。酶解或发酵参数包括pH值、温度、时间、加酶量以及接种量等因素。酶解法所得多肽产物活性高于发酵法,且具有操作简单,容易实现规模化生产等优势,最终选择了蛋白酶解法制备活性多肽。通过单因素和正交实验优化,实验最终选用了木瓜蛋白酶酶解龟肉蛋白制取活性肽的酶解工艺条件为：酶解时间8h,pH7.5,温度60℃,加酶量0.5%,液料比3mL/g。以人乳腺癌细胞株MCF-7为实验对象,采用MTT法考察活性肽的抗肿瘤生物活性。采用超滤分级(截留分子量为10 KDa)和sephadex G-75、sephadex G-50、 sephadex LH-60柱层析法对酶解产物进行分离纯化,最终得到一个活性较高的组分TP-1,具有明显的药物浓度依赖性和时间梯度依赖性,其IC50值约为2.5 mg/mL,且该组分对正常成纤维细胞L929毒性极小。RP-HPLC谱图表明,该组分主成分单一,纯度较高。通过红外吸收、紫外扫描和圆二色谱等方法对其理化性质进行表征,证明该组分符合多肽类物质一般特点,且分子内含有一定量的p-转角和无规卷曲等二级构象,该组分的生物活性极有可能与这些二级结构有直接关系。最后经LC-MS/MS分析测得该组分(TP-1)中主成分多肽分子量约为 8 KDa,其氨基酸序列为QYSTKEDKYEEEIKLLTDKLKEAETRAEFAERSVAKLEKTIDDLEENLASA KEENVGIHQVLDQTLLELNNL,在NCBI中的登录号为K7FRA9。通过细胞划痕实验、DAPI/PI荧光染色实验、流式细胞术实验和动物实验对TP-1体外和体内抗肿瘤效果进行研究,并对其作用机理进行初步探讨。实验结果表明,TP-1可能具有抑制癌细胞迁移能力的作用,还可通过裂解癌细胞的方式致其死亡；TP-1使细胞分裂周期阻滞于G2期从而抑制其生长,且具有剂量和时间依赖性。动物实验结果表明TP-1中等剂量(100mg/kg·d)腹腔注射10天实验小鼠抑瘤率为34%,与对照组差异显著,且对小鼠体重增长影响较小。综上分析表明,该多肽具有一定的药用开发潜力。