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家禽养殖过程中慢性呼吸道疾病的存在可导致孵化率、产蛋率及蛋品质受到严重影响,传统的抗生素类药物和疫苗防治效果的限制使得这类疾病给养殖户及养鸡业带来巨大的经济损失。micro RNA是一类非编码短链单链RNA,因为其进化上的高保守性和胞内作用广泛性,及其在气道炎症中的异常表达,使得miRNA成为控制疾病发生发展的重要影响因子。目前的研究多基于疾病中miRNA异常表达的功能研究,却忽视了导致miRNA异常表达的原因。PRMT1作为一种表观遗传修饰酶,已被证实参与了上皮细胞炎症的发生,并且在我们前期的研究中也证实了PRMT1对miRNA的调控作用。但是,关于PRMT1对miRNA调控的具体机制目前仍是未知。在肺部炎症中PRMT1可以调控哪些miRNA异常表达?哪些炎症因子可以影响PRMT1对miRNA的调控作用?细胞因子调控的PRMT1如何影响miRNA的发生?PRMT1是否会与一些转录因子相互协作来影响miRNA的表达?在这一过程中哪些关键miRNA可以被调控?就这些问题,我们展开本课题的研究。试验一PRMT1调控的snc RNAs在肺部炎症中的作用筛选并鉴定气道炎症中PRMT1调控的miRNAs。肺上皮细胞过表达PRMT1 48h进行small-RNA seq,发现差异表达的miRNA 73个,pi RNA 436个。将差异表达基因与肺炎相关的5个在线数据集差异表达snc RNAs比对后,发现了23种PRMT1调控的肺部炎症相关snc RNA。利用实时荧光定量PCR验证,筛选出12种miRNA和2种pi RNA。通过靶基因KEGG分析PRMT1调控的肺部炎症相关snc RNA的主要靶标是Ras/Rap-MAPK信号通路。试验二PRMT1对pri-miRNA的调控作用肺上皮细胞过表达PRMT1短时间点6h、12h和24h,RT-q PCR检测pri-miRNA的表达。发现PRMT1可以调控pri-let-7i等10种pri-miRNA的表达。使用si-PRMT1敲低PRMT124h和48h后RT-q PCR验证发现,let-7i、let-7d、miR-1296、miR-423和miR-550a的成熟miRNA和pri-miRNA均随PRMT1敲低下调。且pri-miRNA的表达变化时间点均在成熟miRNA之前,提示这5种miRNA的转录本(即pri-miRNA)可能通过某种分子机制被PRMT1调控,从而影响成熟miRNA的表达。试验三TGF-β1激活肺上皮细胞中PRMT1对miRNA的调控探究炎症细胞因子引起的PRMT1和miRNA的变化。肺上皮细胞添加IL-4(20ng/m L)、TNF-α(10g/m L)和TGF-β1(5ng/m L)刺激因子24h后检测PRMT1 m RNA和蛋白水平表达,结果显示TGF-β1(5ng/m L)可以显著上调(P<0.1)PRMT1的表达。随后使用TGF-β1刺激上皮细胞(0、3h、6h、12h、24h),发现TGF-β1在短时间(3-12h)显著上调PRMT1,并可显著上调pri-let-7i、pri-let-7d、pri-mir-423和pri-mir-1296的表达。TGF-β1在24h的miRNA检测证实,TGF-β1调控pri-miRNA的同时可以影响成熟miRNA(let-7d、let-7i、miR-423和miR-1296)的表达量。试验四TGF-β1刺激PRMT1调控pri-miRNA表达的机制研究鉴定与PRMT1互作的转录因子,使用在线生信网站预测与PRMT1互作的蛋白质,比对筛选出四种可能与PRMT1互作的转录因子(STAT1、RUNX1、p300和p53)。BEAS-2B分别转染pc DNA3.1和PRMT1 48h收集细胞裂解液,使用Ig G抗体与PRMT1抗体进行免疫沉淀(IP),通过WB分析结果显示,PRMT1确实能与转录因子发生相互作用,并且过表达PRMT1后可以使结合的STAT1和RUNX1明显增多。在BEAS-2B细胞添加TGF-β1刺激分别通过WB、RT-q PCR和细胞免疫荧光检测证明其可以上调STAT1和RUNX1两种转录因子的表达。进一步通过Co-IP证实TGF-β1可以刺激上调PRMT1与STAT1和RUNX1的互作作用。BEAS-2B细胞转染si-PRMT1 6h后加入TGF-β1刺激,通过Co-IP结果证实,抑制PRMT1可以有效降低与PRMT1结合的转录因子的表达,证明TGF-β1可以调控PRMT1与转录因子RUNX1和STAT1的互作作用。试验五鉴定PRMT1-转录因子共同调控pri-let-7i本试验在前面试验的基础上,鉴定受PRMT1和转录因子共同调控的miRNA。首先在添加通过敲低STAT1和RUNX1,使用RT-q PCR技术检测了pri-miRNA的表达,结果显示STAT1敲低可以显著下调pri-let-7d、pri-let-7i、pri-mir-1296、pri-mir-423,敲低RUNX1后pri-let-7i、pri-mir-423表达下调。通过在线生信分析网站预测STAT1和RUNX1对pri-miRNA的调控作用,发现STAT1和RUNX1分别在pri-let-7i和pri-mir-423启动子存在结合位点。随后通过Ch-IP试验,证实STAT1、RUNX1可分别结合于pri-let-7i启动子区,并且PRMT1-转录因子复合物的缺失可以阻断pri-let-7i的转录。综上所述,我们发现了一种气道炎症发生过程中的新机制。肺上皮细胞中,PRMT1的异常表达可以显著影响多种炎症相关成熟miRNA表达;细胞因子TGF-β1可以激活PRMT1对miRNA的调控;激活了的PRMT1作为共转录因子与转录因子STAT1和RUNX1形成转录共激活物,进一步特异性的结合并激活pri-let-7i,从而调控成熟let-7i的表达。