流行性感冒(influenza或者flu),简称流感,是由不同亚型流感病毒(influenza virus)感染诱发的一种常见急性上呼吸道疾病,具有潜伏期短、发病率高、传播速度快及传染性强等特性。目前,流感的治疗手段主要为抗病毒药物,如金刚烷胺类M2离子通道抑制剂、神经氨酸酶(NA)抑制剂及核苷类似物等,主要的预防手段为接种免疫疫苗。但是,流感的预防和治疗仍面临严峻挑战:疫苗对于免疫力低下的老人和孩子效果不佳;绝大部分流感流行病毒株已经对金刚烷胺类M2离子通道抑制剂产生了严重的耐药性;对包括对流感特效药奥司他韦(达菲)等NA抑制剂的耐药性也在逐渐增加。因此,有必要开发全新结构和作用机制的流感病毒抑制剂。Triazavirin是由乌拉尔联邦大学和俄罗斯科学院乌拉尔生物制药技术中心历经20余年共同研制的非核苷类广谱抗病毒药物,于2015年在俄罗斯上市。Triazavirin与盐酸阿比多尔类似,具有良好的体内外抗流感活性,对金刚烷胺耐药的病毒株也有良好的抑制活性,具体作用机制不明。有报道称triazavirin能够与病毒的凝血酶(HA)特异性结合,抑制病毒入侵宿主细胞的早期阶段。鉴于triazavirin的特殊结构和药理学性质,未来有可能与盐酸阿比多尔一样在我国以非专利药品上市,开展对其合成工艺研究,加速实现产业化,对我国流感的防治具有重要意义。本论文为提高Triazavirin原合成路线的总收率,降低生产成本,在原研专利“一锅法”合成triazavirin的基础上,结合具体反应机理,对影响反应的关键因素进行优化。首先通过小试考察原合成工艺,包括反应无机酸的种类,亚硝酸钠的滴加速度,环合反应温度等。同时,我们对所合成的triazavirin通过单晶X射线衍射确定了其绝对构型。最后结合小试结果和反应机理确定了影响反应的6个主要因素,每个因素设置了 5个水平,通过正交试验手段确定了最优反应条件,triazavirin的收率由74%提高到83.7%。为了进一步确证优化后的工艺,我们将反应扩大10倍,结果表明小试三批产率稳定,平均为80%,经HPLC分析三批纯度均大于99.9%,符合中国药典对原料药纯度要求。因此,优化后的合成工艺提供了 一种安全可靠、经济的triazavirin的制备方法。另一方面,为提高triazavirin的代谢稳定性,发现具有更高活性及成药性的衍生物,本文对triazavirin的三唑并三嗪环进行了初步的改造,在易代谢位点C2和C6位进行了修饰。并且基于文献中对于triazavirin的结构修饰和三唑并三嗪类化合物与内源性碱基的结构相似性,设计了全新结构的三唑并三嗪类核苷(酸)类似物。其中,所设计的三唑并三嗪类开环核苷酸类似物结合了美国FDA批准的抗HBV药物阿德福韦酯的开环糖基部分;三唑并三嗪核苷类似物结合了广谱抗病毒药物利巴韦林的呋喃核糖部分,设计了包括乙酸酯在内的一类化合物。考虑到目标化合物的设计引入了抗HBV及抗流感药物的糖基部分,结合课题组前期研究发现的一类结合阿德福韦酯开环糖基部分的噻二嗪类核苷类似物在体外对HBV DNA复制具有良好的抑制活性,我们对目标化合物同时进行了体外抗流感病毒和抗HBV DNA复制实验。结果表明,开环核苷类似物LT4a2对流感病毒株H5N2、H5N6及H5N8具有一定的体外抑制活性(IC50=81.88μM,184.91μM,194.65μM),LTBr对于H5N2及H5N6病毒株具有良好的抑制活性(IC50=15.40μM,15.99μM),与阳性对照利巴韦林(IC50=11.14μM,14.15μM)相当;核苷类似物LTH2c对H5N2和H5N6病毒株的抑制活性(IC50=11.54μM,9.88μM)与利巴韦林相当。同时我们对所有的目标化合物测试了体外抑制H5N1病毒株实验,但是结果表明所有化合物对于H5N1病毒株无明显体外抑制活性(IC50>250μM),说明此类抑制剂对于流感病毒株具有选择性。为了进一步讨论所设计化合物对于流感病毒的抑制作用,多种流感病毒株的活性测试正在进行中。抗HBV活性结果表明,大多数化合物在100μM的浓度时对HBV DNA的复制具有一定的抑制活性,其中LTH1c、LT4a1、LTH2b的抑制率在35.69-43.55%之间,并且没有显示出明显的细胞毒性。说明三唑并三嗪非核苷类及核苷(酸)类似物具有抗HBV活性。虽然目标化合物的抑制活性均低于阳性药物拉米夫定(100μM,抑制率86.7%),但是作为全新结构的抑制剂,有进一步研究的价值。综上所述,本论文改进了 triazavirin“一锅法”的合成工艺,产率由74%提高到了 80%,有望减少工业化生产成本,具有较好的应用前景。同时,设计了全新结构的三唑并三嗪核苷类似物,具有一定的体外抗病毒活性,特别是对于部分甲型流感病毒株。目前为止,未见有三唑并三嗪类化合物抗HBV活性报道,初步的活性筛选结果表明此类化合物具有进一步研发的价值。