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目的视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa,RP)是一种遗传性退行性视网膜病变,致病基因突变造成感光细胞死亡,视力丧失。PARP1依赖性细胞死亡(Parthanatos)是RP感光细胞死亡的主要原因。我们前期研究发现EGR1在RP小鼠视网膜外核层表达,同时EGR1的表达可诱导感光细胞层数减少的同时感光细胞功能波幅下降,所以我们进一步研究EGR1诱导感光细胞死亡的机制,以寻找疾病发生发展的重要靶标分子,为延缓甚至治疗RP提供新的靶点和思路。方法第一部分对视网膜退行性病变(Retinal degeneration,RD)小鼠(Pde6brd1/rd1,Prphrd2/rd2,Pde6brd10/rd10)感光细胞死亡高峰期视网膜组织进行高通量测序,基因同源的C3H野生型小鼠为对照,筛选差异基因,通过Dnase-seq、CHIP-seq、MEME分析PARP1转录起始位点附近的EGR1结合信号。第二部分染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay,CHIP)、双荧光素酶基因报告实验及免疫荧光染色验证EGR1与PARP1结合及其位点。第三部分体内及体外实验验证EGR1上调PARP1,引起PAR聚集,促进感光细胞死亡。首先,免疫荧光、Western blot、qPCR实验检测C3H和rd1小鼠视网膜组织EGR1、PARP1、PAR表达水平;其次,慢病毒过表达及干扰体外培养的C3H和rd1小鼠视网膜植片的Egr1基因,分为Ctrl-sh(EGR1干扰对照组)、sh-EGR1(EGR1干扰组)、Ctrl-m(EGR1过表达对照组)、m-EGR1(EGR1过表达组)四个组,TUNEL检测并统计视网膜外核层TUNEL阳性细胞率,感光细胞层数及外核层厚度,同时Western blot及qPCR及检测EGR1、PARP1、PAR表达变化。第四部分使用MAPK通路抑制剂PD98059(ERK抑制剂)和Tanzisertib(JNK抑制剂)处理体外培养的C3H和rd1小鼠视网膜植片,TUNEL检测并统计视网膜外核层TUNEL 阳性细胞率,感光细胞层数及外核层厚度,同时Western blot检测ERK、JNK、c-Jun磷酸化水平,以及EGR1表达水平,qPCR及检测ERK、JNK、c-Jun、EGR1的mRNA表达变化。结果第一部分 rd1、rd2、rd10小鼠视网膜感光细胞死亡高峰期有所不同,分别为出生后 13 天(Postnatals days 13,P13),P29,P23,而同时期对照组C3H感光细胞死亡处于低水平。与C3H相比,rd1有1926个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs);rd10有 3096 个 DEGs,rd2只有375个DEGs。通过小鼠视网膜组织的DNase-seq、H3K4me3和CTCF的ChIP-seq数据,在Parp1基因启动子上发现一个DNase超敏感位点,进一步发现在Parp1基因启动子区有EGR1结合信号。第二部分C3H和rd1小鼠视网膜组织CHIP和双荧光素报告结果显示EGR1与PARP1启动子DHS结合,结合位点为AACGCCCACGGAAC,免疫荧光检测发现,EGR1和PARP1共同表达于感光细胞核,存在共定位。第三部分rd1小鼠视网膜组织免疫荧光染色显示EGR1、PARP1于P13达到表达高峰期,与感光细胞死亡高峰期重合,而C3H小鼠视网膜组织免疫荧光染色显示 EGR1、PARP1 无明显表达,同时 Western blot、qPCR 显示 EGR1 与 PARP1、PAR表达趋势相同。过表达体外培养的C3H和rd1小鼠视网膜植片Egr1基因,可引起视网膜外核层TUNEL 阳性细胞率明显增加,P9增加最为明显,伴P13视网膜感光细胞层数和外核层厚度明显下降;同时,过表达视网膜植片Egr1基因,引起EGR1、PARP1、PAR蛋白水平和mRNA表达水平明显升高。而抑制体外培养视网膜植片Egr1基因,可以引起rd1小鼠视网膜外核层TUNEL 阳性细胞率明显下降,伴P13视网膜感光细胞层数和外核层厚度下降减少;同时,抑制视网膜植片Egr1基因,引起EGR1、PARP1、PAR蛋白水平和mRNA表达下降。第四部分PD98050和Tanzisertib处理视网膜植片,可引起rd1小鼠视网膜外核层TUNEL 阳性细胞率下降,同时减少感光细胞层数和外核层厚度的下降;Western blot检测结果显示,PD98059和Tanzisertib分别抑制ERK、JNK的磷酸化水平,进而抑制c-Jun的磷酸化,下调EGR1的表达;而qPCR检测显示,PD98059 和 Tanzisertib 下调 ERK、JNK、c-Jun、EGR1 的 mRNA 表达。结论rd1小鼠中,MAPK/ERK/JNK通路激活,c-Jun磷酸化水平增加,从而介导转录因子EGR1水平升高,进而引起PARP1表达水平上升,底物PAR聚集,最终导致视网膜感光细胞通过Parthanatos通路死亡。