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第一部分熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼的毒性评价
目的：
1.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼死亡率、孵化率及发育形态的影响评价；
2.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼作用神经元的鉴别。
方法：
1.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼死亡率、孵化率及发育形态的影响评价：随机选取野生型AB品系斑马鱼受精卵，共设10组，分为空白对照组（WT组）、模型对照组（0.1％DMSO组）、0.1％DMSO+熄风胶囊组（1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml）、0.1％DMSO+全蝎组（1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml），每组30个斑马鱼受精卵，共计300个，置于6孔板。于6hpf（hourspost-fertilization）、8hpf、10hpf、24hpf、48hpf、72hpf、96hpf时，观察并记录受精卵死亡情况，并通过显微镜拍照记录胚胎发育形态，72hpf时观察并记录受精卵孵化情况。共重复3遍。
2.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼作用神经元的鉴别：随机选取野生型AB品系斑马鱼受精卵，共设4组，分为空白对照组（WT组）、模型对照组（0.1％DMSO组）、0.1％DMSO+熄风胶囊组（500μg/ml）、0.1％DMSO+全蝎组（500μg/ml），每组30个斑马鱼受精卵，选取以下4个基因进行观察研究：Ntl基因、Krox20基因、Cmlc2基因、PAX2基因，每个基因共收集120个受精卵，总计480个，置于6孔板。根据本实验需要，于以下胚胎发育时期进行取材：Ntl-10hpf、Krox20-12hpf、Cmlc2-33hpf、PAX2-33hpf，用4％多聚甲醛固定胚胎，4℃保存备用。采用原位杂交技术处理胚胎，具体实验流程包括：第一天：PBST洗3次，5min/次，用镊子剥掉卵膜，PBST洗1次，10min/次，10μg/ml蛋白酶K37℃水浴，PBST洗2次，5min/次，加入杂交液，于杂交炉中65℃预杂交4h，加入RNA探针，杂交炉中60℃过夜；第二天：回收探针，加入洗液Ⅰ，于杂交炉中60℃洗2次，30min/次，更换为2×SSCT，于杂交炉中60℃洗1次，15min/次，更换为0.2×SSCT，于杂交炉中60℃洗2次，30min/次，MABT洗3次，5min/次，封闭液中孵育3h，加入抗体4℃过夜；第三天：MABT洗8次，15min/次，换为PBST洗5次，10min/次，换至APbuffer室温静置10min，加入NBT/BCIP显色试剂，避光反应约1h，显微镜观察颜色反应。通过显微镜拍照，并记录胚胎发育早期不同器官的表达，以观察熄风胶囊和全蝎作用的神经元，鉴别其毒性靶器官。
结果：
1.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼死亡率、孵化率的影响：随着浓度升高，熄风胶囊和全蝎作用于斑马鱼幼鱼的致死率逐渐升高。在1000μg/mL浓度下，熄风胶囊组诱发97.58％斑马鱼幼鱼死亡，全蝎组仅诱发45.18％斑马鱼幼鱼死亡，提示熄风胶囊对斑马鱼幼鱼致死率高于全蝎；在125μg/mL浓度下，熄风胶囊组仅诱发5.93％斑马鱼幼鱼死亡，全蝎组诱发9.24％斑马鱼幼鱼死亡，均低于空白对照组（12.71％），提示在最低浓度情况下熄风胶囊和全蝎对斑马鱼幼鱼有一定的保护作用。6hpf时，熄风胶囊最高浓度组的死亡率已达到92.56％；48hpf时，熄风胶囊组和全蝎组作用于斑马鱼幼鱼的致死率明显较前升高。72hpf时，熄风胶囊500μg/mL（73.81％）和全蝎500μg/mL（77.36％）浓度组的孵化率均明显低于其余实验组，差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼发育形态的影响：熄风胶囊500μg/mL浓度组可诱发幼鱼明显发育延迟、体轴弯曲、卵黄囊吸收延迟及鱼鳔缺失；250μg/mL浓度组可诱发幼鱼发育延迟、体轴弯曲、头部和眼变小、心包水肿、卵黄囊吸收延迟及鱼鳔变小；125μg/mL浓度组可诱发幼鱼鱼鳔缺失。全蝎1000μg/mL浓度组可诱发幼鱼体轴弯曲、卵黄囊吸收延迟、鱼鳔缺失；500μg/mL浓度组可诱发幼鱼发育延迟；250μg/mL浓度组可诱发幼鱼体轴弯曲；125μg/mL浓度组未诱发任何毒性表型。
熄风胶囊和全蝎诱发幼鱼发育异常，在6-10hpf时表现为外包延迟并增厚，24hpf时表现为体轴弯曲，48hpf时可表现为卵黄囊吸收延迟以及头部和眼变小，72hpf时可表现为卵黄囊吸收延迟以及心包水肿，96hpf时表现为鱼鳔缺失。
3.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼作用神经元的鉴别：熄风胶囊500μg/ml浓度组明显影响斑马鱼幼鱼的基因表达，所致异常表型率排序依次为：Ntl基因（52.63％）＞Cmlc2基因（52.38％）＞PAX2基因（39.13％）＞Krox20基因（27.78％），提示熄风胶囊对斑马鱼幼鱼Ntl基因和Cmlc2基因的表达影响显著。全蝎500μg/ml浓度组正常表型率排序依次为：Cmlc2基因（95.12％）＞PAX2基因（89.58％）＞Ntl基因（66.67％）＞Krox20基因（66.67％），提示全蝎对斑马鱼幼鱼Ntl基因和Krox20基因的表达影响明显。
第二部分熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型的疗效评价
目的：
1.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型行为学的影响评价；
2.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型GABA信号转导通路合成及代谢的影响评价。
方法：
1.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型运动行为的影响：随机选取野生型AB品系6dpf（dayspost-fertilization）斑马鱼，共设12组，分为空白对照组（WT组）、模型对照组（PTZ组）、熄风胶囊组（2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml）、全蝎组（2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml），每组30尾斑马鱼，共计360尾，置于96孔板，每孔1尾。熄风胶囊组和全蝎组分别用药24小时后，除空白对照组外，其余实验组均给予戊四唑诱导1小时建立癫痫模型。利用斑马鱼行为轨迹跟踪系统记录1小时内斑马鱼的运动情况，分析统计斑马鱼的平均运动速度和总运动距离。共重复3遍。
2.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型GABA信号转导通路合成及代谢的影响评价：随机选取野生型AB品系6dpf斑马鱼，共设12组，分为空白对照组（WT组）、模型对照组（PTZ组）、熄风胶囊组（2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml）、全蝎组（2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml），每组30尾斑马鱼，共计360尾，置于96孔板，每孔1尾。熄风胶囊组和全蝎组分别用药24小时后，除空白对照组外，其余实验组均给予戊四唑诱导1小时建立癫痫模型。每组收集幼鱼30只，称重并记录；加入PBS缓冲液，保持4℃的温度，用匀浆仪将标本匀浆充分；2000转/min离心20min，仔细收集上清液保存于-20℃备用。酶联免疫分析严格参照各试剂盒说明书进行操作。检测斑马鱼组织中GABA、GAD、VGAT的含量以评价熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型GABA信号转导通路合成的影响，检测斑马鱼组织中GAT、GABA-T的含量以评价熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型GABA信号转导通路代谢的影响。共重复3遍。
结果：
1.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型行为学的影响：熄风胶囊和全蝎可显著减少斑马鱼癫痫模型的平均运动速度，缩短斑马鱼癫痫模型的总运动距离，提示熄风胶囊和全蝎对斑马鱼幼鱼具有明显抗癫痫作用。
2.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼癫痫模型GABA信号转导通路合成的影响：熄风胶囊和全蝎可以升高斑马鱼癫痫模型的GABA和GAD含量，提示熄风胶囊和全蝎可以有效抑制斑马鱼癫痫发作；熄风胶囊和全蝎可以降低斑马鱼癫痫模型的VGAT含量，提示熄风胶囊和全蝎可以通过减少GABA降解从而抑制斑马鱼癫痫发作。
3.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼癫痫模型GABA信号转导通路代谢的影响：熄风胶囊和全蝎可以降低斑马鱼癫痫模型的GAT含量，提示熄风胶囊和全蝎可以通过增加GABA从而抑制斑马鱼癫痫发作的作用；熄风胶囊和全蝎不能升高斑马鱼癫痫模型的GABA-T含量，提示熄风胶囊和全蝎对GABA-T的含量无影响。
结论：
1.随着浓度升高，熄风胶囊和全蝎致死率逐渐升高；其中熄风胶囊最高浓度组死亡率最高；熄风胶囊和全蝎最低浓度组的死亡率均低于空白对照组；熄风胶囊和全蝎500μg/mL浓度组的孵化率均明显低于其余实验组。熄风胶囊500μg/mL浓度组可诱发幼鱼明显发育延迟、体轴弯曲、卵黄囊吸收延迟及鱼鳔缺失；250μg/mL浓度组可诱发幼鱼发育延迟、体轴弯曲、头部和眼变小、心包水肿、卵黄囊吸收延迟及鱼鳔变小；125μg/mL浓度组可诱发幼鱼鱼鳔缺失。全蝎1000μg/mL浓度组可诱发幼鱼体轴弯曲、卵黄囊吸收延迟、鱼鳔缺失；500μg/mL浓度组可诱发幼鱼发育延迟；250μg/mL浓度组可诱发幼鱼体轴弯曲；125μg/mL浓度组未诱发任何毒性表型。熄风胶囊对斑马鱼幼鱼Ntl基因和Cmlc2基因的表达影响显著，全蝎对斑马鱼幼鱼Ntl基因和Krox20基因的表达影响明显。
2.熄风胶囊和全蝎可显著减少斑马鱼癫痫模型的平均运动速度和总运动距离，提示熄风胶囊和全蝎对斑马鱼幼鱼具有明显抗癫痫作用。熄风胶囊和全蝎可以升高斑马鱼癫痫模型的GABA和GAD含量，降低VGAT含量，提示熄风胶囊和全蝎可以通过促进GABA信号传导通路的合成以抑制斑马鱼癫痫发作；熄风胶囊和全蝎可以降低斑马鱼癫痫模型的GAT含量，但无法升高GABA-T含量，提示熄风胶囊和全蝎对GAT含量的影响显著。
目的：
1.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼死亡率、孵化率及发育形态的影响评价；
2.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼作用神经元的鉴别。
方法：
1.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼死亡率、孵化率及发育形态的影响评价：随机选取野生型AB品系斑马鱼受精卵，共设10组，分为空白对照组（WT组）、模型对照组（0.1％DMSO组）、0.1％DMSO+熄风胶囊组（1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml）、0.1％DMSO+全蝎组（1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml），每组30个斑马鱼受精卵，共计300个，置于6孔板。于6hpf（hourspost-fertilization）、8hpf、10hpf、24hpf、48hpf、72hpf、96hpf时，观察并记录受精卵死亡情况，并通过显微镜拍照记录胚胎发育形态，72hpf时观察并记录受精卵孵化情况。共重复3遍。
2.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼作用神经元的鉴别：随机选取野生型AB品系斑马鱼受精卵，共设4组，分为空白对照组（WT组）、模型对照组（0.1％DMSO组）、0.1％DMSO+熄风胶囊组（500μg/ml）、0.1％DMSO+全蝎组（500μg/ml），每组30个斑马鱼受精卵，选取以下4个基因进行观察研究：Ntl基因、Krox20基因、Cmlc2基因、PAX2基因，每个基因共收集120个受精卵，总计480个，置于6孔板。根据本实验需要，于以下胚胎发育时期进行取材：Ntl-10hpf、Krox20-12hpf、Cmlc2-33hpf、PAX2-33hpf，用4％多聚甲醛固定胚胎，4℃保存备用。采用原位杂交技术处理胚胎，具体实验流程包括：第一天：PBST洗3次，5min/次，用镊子剥掉卵膜，PBST洗1次，10min/次，10μg/ml蛋白酶K37℃水浴，PBST洗2次，5min/次，加入杂交液，于杂交炉中65℃预杂交4h，加入RNA探针，杂交炉中60℃过夜；第二天：回收探针，加入洗液Ⅰ，于杂交炉中60℃洗2次，30min/次，更换为2×SSCT，于杂交炉中60℃洗1次，15min/次，更换为0.2×SSCT，于杂交炉中60℃洗2次，30min/次，MABT洗3次，5min/次，封闭液中孵育3h，加入抗体4℃过夜；第三天：MABT洗8次，15min/次，换为PBST洗5次，10min/次，换至APbuffer室温静置10min，加入NBT/BCIP显色试剂，避光反应约1h，显微镜观察颜色反应。通过显微镜拍照，并记录胚胎发育早期不同器官的表达，以观察熄风胶囊和全蝎作用的神经元，鉴别其毒性靶器官。
结果：
1.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼死亡率、孵化率的影响：随着浓度升高，熄风胶囊和全蝎作用于斑马鱼幼鱼的致死率逐渐升高。在1000μg/mL浓度下，熄风胶囊组诱发97.58％斑马鱼幼鱼死亡，全蝎组仅诱发45.18％斑马鱼幼鱼死亡，提示熄风胶囊对斑马鱼幼鱼致死率高于全蝎；在125μg/mL浓度下，熄风胶囊组仅诱发5.93％斑马鱼幼鱼死亡，全蝎组诱发9.24％斑马鱼幼鱼死亡，均低于空白对照组（12.71％），提示在最低浓度情况下熄风胶囊和全蝎对斑马鱼幼鱼有一定的保护作用。6hpf时，熄风胶囊最高浓度组的死亡率已达到92.56％；48hpf时，熄风胶囊组和全蝎组作用于斑马鱼幼鱼的致死率明显较前升高。72hpf时，熄风胶囊500μg/mL（73.81％）和全蝎500μg/mL（77.36％）浓度组的孵化率均明显低于其余实验组，差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼发育形态的影响：熄风胶囊500μg/mL浓度组可诱发幼鱼明显发育延迟、体轴弯曲、卵黄囊吸收延迟及鱼鳔缺失；250μg/mL浓度组可诱发幼鱼发育延迟、体轴弯曲、头部和眼变小、心包水肿、卵黄囊吸收延迟及鱼鳔变小；125μg/mL浓度组可诱发幼鱼鱼鳔缺失。全蝎1000μg/mL浓度组可诱发幼鱼体轴弯曲、卵黄囊吸收延迟、鱼鳔缺失；500μg/mL浓度组可诱发幼鱼发育延迟；250μg/mL浓度组可诱发幼鱼体轴弯曲；125μg/mL浓度组未诱发任何毒性表型。
熄风胶囊和全蝎诱发幼鱼发育异常，在6-10hpf时表现为外包延迟并增厚，24hpf时表现为体轴弯曲，48hpf时可表现为卵黄囊吸收延迟以及头部和眼变小，72hpf时可表现为卵黄囊吸收延迟以及心包水肿，96hpf时表现为鱼鳔缺失。
3.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼作用神经元的鉴别：熄风胶囊500μg/ml浓度组明显影响斑马鱼幼鱼的基因表达，所致异常表型率排序依次为：Ntl基因（52.63％）＞Cmlc2基因（52.38％）＞PAX2基因（39.13％）＞Krox20基因（27.78％），提示熄风胶囊对斑马鱼幼鱼Ntl基因和Cmlc2基因的表达影响显著。全蝎500μg/ml浓度组正常表型率排序依次为：Cmlc2基因（95.12％）＞PAX2基因（89.58％）＞Ntl基因（66.67％）＞Krox20基因（66.67％），提示全蝎对斑马鱼幼鱼Ntl基因和Krox20基因的表达影响明显。
第二部分熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型的疗效评价
目的：
1.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型行为学的影响评价；
2.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型GABA信号转导通路合成及代谢的影响评价。
方法：
1.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型运动行为的影响：随机选取野生型AB品系6dpf（dayspost-fertilization）斑马鱼，共设12组，分为空白对照组（WT组）、模型对照组（PTZ组）、熄风胶囊组（2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml）、全蝎组（2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml），每组30尾斑马鱼，共计360尾，置于96孔板，每孔1尾。熄风胶囊组和全蝎组分别用药24小时后，除空白对照组外，其余实验组均给予戊四唑诱导1小时建立癫痫模型。利用斑马鱼行为轨迹跟踪系统记录1小时内斑马鱼的运动情况，分析统计斑马鱼的平均运动速度和总运动距离。共重复3遍。
2.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型GABA信号转导通路合成及代谢的影响评价：随机选取野生型AB品系6dpf斑马鱼，共设12组，分为空白对照组（WT组）、模型对照组（PTZ组）、熄风胶囊组（2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml）、全蝎组（2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml），每组30尾斑马鱼，共计360尾，置于96孔板，每孔1尾。熄风胶囊组和全蝎组分别用药24小时后，除空白对照组外，其余实验组均给予戊四唑诱导1小时建立癫痫模型。每组收集幼鱼30只，称重并记录；加入PBS缓冲液，保持4℃的温度，用匀浆仪将标本匀浆充分；2000转/min离心20min，仔细收集上清液保存于-20℃备用。酶联免疫分析严格参照各试剂盒说明书进行操作。检测斑马鱼组织中GABA、GAD、VGAT的含量以评价熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型GABA信号转导通路合成的影响，检测斑马鱼组织中GAT、GABA-T的含量以评价熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型GABA信号转导通路代谢的影响。共重复3遍。
结果：
1.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼癫痫模型行为学的影响：熄风胶囊和全蝎可显著减少斑马鱼癫痫模型的平均运动速度，缩短斑马鱼癫痫模型的总运动距离，提示熄风胶囊和全蝎对斑马鱼幼鱼具有明显抗癫痫作用。
2.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼癫痫模型GABA信号转导通路合成的影响：熄风胶囊和全蝎可以升高斑马鱼癫痫模型的GABA和GAD含量，提示熄风胶囊和全蝎可以有效抑制斑马鱼癫痫发作；熄风胶囊和全蝎可以降低斑马鱼癫痫模型的VGAT含量，提示熄风胶囊和全蝎可以通过减少GABA降解从而抑制斑马鱼癫痫发作。
3.熄风胶囊/全蝎对斑马鱼幼鱼癫痫模型GABA信号转导通路代谢的影响：熄风胶囊和全蝎可以降低斑马鱼癫痫模型的GAT含量，提示熄风胶囊和全蝎可以通过增加GABA从而抑制斑马鱼癫痫发作的作用；熄风胶囊和全蝎不能升高斑马鱼癫痫模型的GABA-T含量，提示熄风胶囊和全蝎对GABA-T的含量无影响。
结论：
1.随着浓度升高，熄风胶囊和全蝎致死率逐渐升高；其中熄风胶囊最高浓度组死亡率最高；熄风胶囊和全蝎最低浓度组的死亡率均低于空白对照组；熄风胶囊和全蝎500μg/mL浓度组的孵化率均明显低于其余实验组。熄风胶囊500μg/mL浓度组可诱发幼鱼明显发育延迟、体轴弯曲、卵黄囊吸收延迟及鱼鳔缺失；250μg/mL浓度组可诱发幼鱼发育延迟、体轴弯曲、头部和眼变小、心包水肿、卵黄囊吸收延迟及鱼鳔变小；125μg/mL浓度组可诱发幼鱼鱼鳔缺失。全蝎1000μg/mL浓度组可诱发幼鱼体轴弯曲、卵黄囊吸收延迟、鱼鳔缺失；500μg/mL浓度组可诱发幼鱼发育延迟；250μg/mL浓度组可诱发幼鱼体轴弯曲；125μg/mL浓度组未诱发任何毒性表型。熄风胶囊对斑马鱼幼鱼Ntl基因和Cmlc2基因的表达影响显著，全蝎对斑马鱼幼鱼Ntl基因和Krox20基因的表达影响明显。
2.熄风胶囊和全蝎可显著减少斑马鱼癫痫模型的平均运动速度和总运动距离，提示熄风胶囊和全蝎对斑马鱼幼鱼具有明显抗癫痫作用。熄风胶囊和全蝎可以升高斑马鱼癫痫模型的GABA和GAD含量，降低VGAT含量，提示熄风胶囊和全蝎可以通过促进GABA信号传导通路的合成以抑制斑马鱼癫痫发作；熄风胶囊和全蝎可以降低斑马鱼癫痫模型的GAT含量，但无法升高GABA-T含量，提示熄风胶囊和全蝎对GAT含量的影响显著。