研究背景：慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种发生于造血干细胞水平的血液系统恶性克隆增生性疾病,在我国CML占总白血病发病率的20%左右。CML患者的骨髓细胞中可检测到特异性的Ph染色体,它是由于t(9;22)(q34；q11)染色体易位形成的，从而导致BCR-ABL基因融合并表达210KD的BCR-ABL融合蛋白。BCR-ABL蛋白在慢性粒细胞白血病细胞恶性增殖过程中发挥着重要作用,因而成为Ph+慢性粒细胞白血病的重要治疗靶点。第一代以BCR-ABL蛋白为靶标的分子靶向药物--伊马替尼(Imatinib,IM)已成为治疗CML的一线药物。然而,令人遗憾的是,伊马替尼类分子靶向药物不能完全清除患者体内BCR-ABL阳性白血病细胞克隆,并不能使多数CML患者获得长期缓解，停药后很快复发,其中一些患者对伊马替尼类分子靶向药物产生耐药。并且,越来越多的临床和实验研究资料显示,单用分子靶向药物只能控制慢性期CML,而对加速期和急变期CML基本无效,更不能治愈CML。随着近年来不断深入的研究.揭示白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC)是白血病复发和耐药的主要根源,而伊马替尼类分子靶向药物对白血病干细胞无效。因为白血病干细胞通常处在休眠状态,很难被伊马替尼类分子靶向药物和经典化疗药物清除,从而留下白血病复发根源。CML患者要获得长期缓解和治愈,不仅需要杀死快速增殖的白血病细胞,而且还要清除处在休眠期的白血病干细胞。已有研究表明很多蛋白,如β-catenin, NF-κB等分子,与白血病干细胞的存活、自我更新和凋亡抵抗有关。但是这些分子在正常造血干细胞中也起着相似的作用,没有明显的特异性。因此,鉴定白血病干细胞特异性的蛋白靶标,并继而研发新型分子靶向药物就显得十分迫切。小檗胺(Berbamine, BBM)是从我国中草药小檗属植物中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱药物。多年来一直广泛应用于临床,如抗炎和白细胞减少的治疗。我们前期研究结果显示,在体外小檗胺可以有效抑制对伊马替尼耐药的CML细胞的增殖,但对正常造血细胞增殖没有明显抑制作用。这表明小檗胺很可能对CML干细胞具有特异性杀伤作用,这将对CML的根治具有重要的临床意义。因此本研究将对其具体作用机制进行初步探讨。研究目的：1、研究天然小分子化合物小檗胺(BBM)对裸鼠慢性粒细胞白血病细胞移植瘤的清除作用。2、筛选并鉴定BBM抗慢性粒细胞白血病作用的靶分子。3、阐明该靶分子调控慢性粒细胞白血病干细胞存活、自我更新和凋亡抵抗的分子机制,从而明确BBM对慢性粒细胞白血病细胞清除作用的内在分子机制。研究内容：1天然小分子化合物小檗胺(BBM)对裸鼠慢性粒细胞白血病细胞移植瘤的清除作用研究我们分别用急变期CML细胞敏感株K562-S和耐受伊马替尼(IM)的耐药株K562-R(经流式细胞仪测定含1-2% CD34+白血病干细胞)建立裸鼠荷瘤模型。结果显示,荷瘤裸鼠连续口服小檗胺(150mg/kg,每天1次)10天后,70%(14/20)K562-S白血病细胞异种移植瘤完全消退；荷瘤裸鼠连续口服小檗胺(100mg/kg,每天3次)10天后,其体内伊马替尼耐药的K562-R白血病细胞移植瘤抑制率达到90.91%(10/11)。而且在实验观察期间没有发现明显的药物毒副作用。2小檗胺抗慢性粒细胞白血病作用靶分子CaMKIIγ激酶的鉴定本部分联合应用小檗胺亲和基质,蛋白质谱和Western blot技术方法发现并证实：BBM能与活化的钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱγ(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIγ,简称CaMKIIγ)发生特异性作用。进一步应用计算机分子对接模型(molecular docking model)模拟显示小檗胺主要以范德华力(van der Waals forces)与CaMKII y激酶P44, V47,164, V93, P109, V112和L162氨基酸残基结合,并且其位置正好位于CaMKIIγ激酶的ATP结合袋(ATPbinding pocket)。而Western blot结果显示BBM处理白血病细胞后,CaMKIIγ的磷酸化水平(pCaMKIIγ)显著降低,而CaMKIIγ总蛋白水平没有明显变化。这提示小檗胺很可能通过与ATP竞争性结合CaMKIIγ激酶而抑制其磷酸化水平。3 CaMKIIγ激酶调控慢性粒细胞白血病干细胞存活、自我更新和凋亡抵抗的分子机制研究3.1 CaMKIIγ激酶在CD34+白血病细胞中特异性异常激活应用流式细胞分选技术分选出CML干细胞,用Western blot技术对其CaMKIIγ激酶表达水平进行检测和分析。并检测CaMKIIγ激酶在CML干细胞与正常造血干细胞中的表达水平。发现CaMKIIγ激酶在CD34+的CML干细胞中呈特异性高表达,并且其磷酸化水平也较高,而在相应CD34-的CML细胞和正常造血干细胞中表达水平很低。3.2 CaMKIIγ激酶与CML干细胞的存活密切相关,且促进LSC的自我更新应用特异性反义核酸下调K562细胞CaMKIIγ激酶表达水平,观察对细胞增殖的影响,结果显示,下调CaMKIIγ激酶表达水平后,白血病克隆形成能力被明显抑制。利用细胞转染技术上调K562细胞CaMKIIγ激酶表达水平,观察CD34+的干细胞数目,以及对克隆形成能力的影响。发现上调CaMKIIγ激酶表达水平可以增加CD34+的干细胞比例以及增强细胞克隆形成能力。3.3 CaMKIIγ激酶促进裸鼠CML异种移植瘤的成瘤能力将稳定转染pcDNA3.1-EGFP和pcDNA3.1-CaMKIIγ-EGFP的K562细胞分别接种至同一只裸鼠两侧皮下。通过比较两侧异种移植瘤的大小来观察上调CaMKIIγγ激酶水平对白血病细胞增殖能力的影响。结果显示CaMKIIγ激酶高表达可以增强K562细胞裸鼠异种移植瘤成瘤能力。且发现稳定转染CaMKIIγ的K562细胞裸鼠异种移植肿瘤中,干细胞样的原始肿瘤细胞数量显著高于对照组。3.4 CaMKIIγ激酶促进慢性粒细胞白血病干细胞存活,自我更新和凋亡抵抗的机制通过Western blot技术检测,CaMKIIγ激酶高表达对与LSC存活、自我更新和凋亡抵抗密切相关的重要信号分子蛋白β-catenin、GSK3β和Caspase-2等表达水平的影响。结果显示,稳定高表达CaMKIIγ的K562细胞中,p-GSK和β-catenin的蛋白表达水平显著升高,Caspase-2的表达水平明显下降。而且流式分选结果显示CML患者骨髓细胞中CD34+的CML干细胞内β-catenin蛋白高表达。提示CaMKIIγ激酶可能通过磷酸化GSK3导致其活性被抑制,进而解除GSK3对P-catenin的抑制作用,最终实现对Wnt/β-Catenin信号通路正调控,促进LSC存活和自我更新；另一方面可能通过抑制Caspase-2活性,使细胞产生凋亡抵抗。3.5 CaMKIIγ激酶可能是调控GSK3/Wnt/β-catenin和线粒体(?)Caspase-2信号通路的重要分子开关,且能与GSK3分子形成信号转导复合体本部分实验通过免疫共沉淀的方法,进一步鉴定及证实慢性粒细胞白血病干细胞内CaMKIIγ激酶主要信号转导复合体的核心组分。结果显示,应用CaMKIIγ激酶特异性抗体进行免疫共沉淀CaMKIIγ激酶相关信号转导复合体,用Westernblot技术验证出在该复合体中存在β-catenin, GSK3/β和Caspase-2蛋白。应用GSK3/β特异性抗体进行免疫共沉淀,并用Western blot技术验证出CaMKIIγ蛋白能和GSK3/γ结合。以上结果表明CaMKIIγ激酶可能是调控GSK3/Wnt/β-catenin和线粒体/Caspase-2信号通路的重要分子开关,且能与GSK3分子形成信号转导复合体。3.6 CaMKIIγ激酶抑制剂BBM对K562-R细胞中干细胞相关重要分子β-catenin表达水平的抑制作用采用Western blot技术检测BBM作为CaMKIIγ激酶抑制剂,是否可以抑制LSC中与存活,自我更新和凋亡抵抗密切相关的重要信号分子β-catenin蛋白表达水平。结果显示,BBM可以显著抑制慢性粒细胞白血病细胞K562-R的β-catenin蛋白表达水平。研究结论：1、小檗胺不仅杀灭裸鼠体内增殖活跃的人慢性粒细胞白血病细胞,还可能清除处在休眠状态的慢性粒细胞白血病干细胞,并且在治疗剂量下小檗胺对裸鼠没有明显的毒副作用。2. CaMKIIγ激酶是小檗胺抗慢性粒细胞白血病作用的靶分子。小檗胺能特异性结合CaMKIIγ激酶的ATP结合袋结构域,并抑制CaMKIIγ的磷酸化。3. CaMKIIγ激酶可能是调控GSK3/Wnt/p-catenin和线粒体/Caspase-2信号通路的重要分子开关。CaMKIIγ通过磷酸化GSK3导致其活性被抑制,进而解除GSK3对β-catenin的抑制作用,最终实现对Wnt/β-Catenin信号通路正调控,促进LSC存活和自我更新；另一方面可能通过抑制Caspase-2活性,使细胞产生凋亡抵抗。4、小檗胺可能通过直接结合于CaMKIIy激酶的ATP结合袋,从而抑制CaMKIIy激酶磷酸化,导致其活性下调,进而抑制GSK3/Wnt/β-Catenin信号通路,激活Caspase-2,使CML干细胞死亡。