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卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。美国癌症协会预测，2018年美国将有22240名妇女被诊断为卵巢癌，14070名妇女将死于此病。此外，2006年至2012年卵巢癌患者的五年总生存率为47％，特别是晚期患者只有29％。值得注意的是，自30年前引入铂类治疗以来，上皮性卵巢癌患者的长期生存率几乎没有变化。尽管大多数卵巢癌患者会对初次手术和化疗产生反应，但是大多数患者最终会发生疾病的复发和转移。证据表明卵巢癌中包含具有正常干细胞特征的小群体肿瘤细胞，即所谓的肿瘤干细胞(CSC)或肿瘤干细胞样细胞(CSLCs)。这一类细胞拥有维持自我更新、分化和成瘤等能力，被认为是肿瘤复发的根本原因。因此，开发靶向肿瘤干细胞的治疗策略已被推进，旨在降低卵巢癌致死率。但是对肿瘤干细胞的识别和根除没有像最初所希望的那样有效。因此，阐明维持肿瘤干细胞特征的分子机制非常重要，有助于促进靶向干细胞药物的开发。
前期研究已成功诱导和鉴定卵巢癌干细胞样细胞。在本研究中，利用LC-MS/MS无标记定量蛋白质组学和生物信息学分析，将Stonin2(STON2)鉴定为卵巢癌干细胞样细胞中差异表达蛋白。然而，目前对于STON2在癌症中的功能知之甚少，特别是与干性有关。依据先前STON2功能研究结果，推测卵巢癌干细胞样细胞STON2表达下调可能参与了其干细胞特征的维持。
在本研究中，首先对蛋白组学筛选的STON2表达下调进行验证，证实下调STON2表达能促进卵巢癌干细胞样细胞干性的维持，表现为CD44+CD24-细胞亚群比例，干性相关蛋白Nanog和C-myc表达和自我更新成球能力增强，EMT相关标志物E-cadherin降低，而N-cadherin与Fibronectin升高。反之亦然。在此基础上，通过RNA-Seq及信息学分析，筛选出差异基因MUC1，随后用RT-PCR和Western blot验证STON2的下调后，MUC1升高;再用shRNA和过表达分别调控MUC1表达，卵巢癌干细胞样细胞干性特征随之正向改变;共表达MUC1与STON2，自我更新成球能力再次增强。证明MUC1作为下游分子参与STON2调控卵巢癌干细胞样细胞的干性活性。再通过焦磷酸甲基化测序，发现siRNA下调STON2后，MUC1启动子甲基化和DNMT1表达降低，而MUC1的表达升高;MUC1表达随DNMT1降低而升高;从而证实STON2通过调控DNMT1改变MUC1启动子甲基化水平，进而调控MUC1的表达。本研究首次证明了STON2通过DNMT1-MUC1途径调节卵巢癌干细胞样细胞的干性活性，为研发靶向干细胞药物提供了实验证据。
第一部分STON2对卵巢癌干细胞样细胞干性特征的影响
目的:
通过观察经无血清培养的卵巢癌干细胞样细胞中STON2的表达变化，以及调控STON2检测CD44+CD24-细胞亚群比例，干性相关蛋白Nanog和C-myc，EMT相关标志物和自我更新成球能力的变化，确定STON2对卵巢癌干细胞样细胞干性特征的影响。
方法:
本研究首先以Western blot证实STON2在卵巢癌干细胞样细胞中表达差异;再用shRNA和过表达分别调控STON2表达后，观察卵巢癌干细胞样细胞干性特征的变化，以FCM检测CD44+CD24-细胞亚群比例，Western blot检测干性相关蛋白Nanog和C-myc，RT-PCR检测EMT相关标志物E-cadherin、N-cadherin和Fibronectin，自我更新成球能力，以及体外NOD/SCID鼠成瘤能力为观察指标。旨在阐明STON2对卵巢癌干细胞样细胞干性特征的调控作用。
结果:
1.RT-PCR、Western blot结果均证实STON2在卵巢癌干细胞样细胞中表达低于亲本细胞，差异具有显著性(p＜0.05)。
2.STON2低表达促进卵巢癌干细胞样细胞干性特征，表现为CD44+CD24-比例增高，干性相关蛋白Nanog和C-myc表达增加，自我更新成球能力增强。
3.STON2低表达促进上皮间质转化，表现为E-cadherin降低，而N-cadherin与Fibronectin升高。
4.STON2低表达促进体内成瘤。
5.STON2高表达抑制卵巢癌干细胞样细胞干性特征，表现为CD44+CD24-比例降低，干性相关蛋白Nanog和C-myc表达降低，自我更新成球能力减弱。
6.STON2高表达抑制上皮间质转化，表现为E-cadherin升高，而N-cadherin与Fibronectin降低。
结论:
1.STON2在卵巢癌干细胞样细胞中低表达。
2.下调STON2能促进卵巢癌干细胞样细胞干性特征及上皮间质化。
3.上调STON2能抑制卵巢癌干细胞样细胞干性特征及上皮间质化。
第二部分MUC1作为STON2的下游靶基因参与调节卵巢癌干细胞样细胞干性特征
目的:
通过RNA-seq和生物信息学分析方法，筛选并验证参与STON2调节卵巢癌干细胞样细胞干性特征的下游靶基因。
方法:
首先，收集shNC和shSton2肿瘤干细胞样细胞，提取总RNA，并在IlluminaHiseq平台上进行RNA-seq检测（每组设3次生物学重复）。测序得到的数据进行生物信息学分析，筛选差异表达基因，并进行KEGG和GO聚类分析。筛选出差异最明显的基因MUC1。随后采用RT-PCR和Western blot观察STON2的下调后，MUC1表达情况;再用shRNA和过表达分别调控MUC1表达后，观察卵巢癌干细胞样细胞干性特征的变化，以FCM检测CD44+CD24-细胞亚群比例，Western blot检测干性相关蛋白Nanog和C-myc为观察指标。同时过表达MUC1与STON2，观察MUC1对STON2过表达所导致的自我更新成球能力改变的影响。
结果:
1.RNA-seq测序共得到824个差异表达基因，其中包括299个下调基因，525个上调基因，其中MUC1上调最为显著。
2.GO及KEGG聚类分析发现分子功能主要体现在相互结合，酶抑制活性等。
3.RT-PCR和Western blot证实MUC1是STON2的下游靶基因，差异具有显著性(p＜0.05)。
4.MUC1低表达抑制卵巢癌干细胞样细胞干性特征，表现为CD44+CD24-比例以及干性相关蛋白Nanog和C-myc表达降低。
5.MUC1高表达促进卵巢癌干细胞样细胞干性特征，表现为CD44+CD24-比例以及干性相关蛋白Nanog和C-myc表达升高。
6.MUC1作为STON2的下游靶基因参与调节卵巢癌干细胞样细胞干性特征。
结论:
1.MUC1是STON2的下游靶基因。
2.MUC1正向调控卵巢癌干细胞样细胞干性特征。
3.MUC1作为STON2的下游靶基因参与调节卵巢癌干细胞样细胞干性特征。
第三部分STON2通过DNMT1调控MUC1启动子区DNA甲基化及其表达
目的:
研究STON2对MUC1的调控机制。
方法:
首先，用DNA甲基化抑制剂处理经siNC和siRNA-STON2转染的细胞，RT-PCR观察MUC1mRNA水平;其次用siRNA调控STON2表达后，焦磷酸测序分方法观察MUC1启动子富含CpG区的甲基化状态;用siRNA调控STON2表达后，Western blot检测DNMT1和MUC1的表达;最后用siRNA调控DNMT1表达后，RT-PCR和Western blot检测MUC1表达。
结果:
1.特异性siRNA下调STON2后，MUC1启动子区DNA甲基化和DNMT1表达降低，而MUC1表达升高。
2.特异性siRNA下调DNMT1后，MUC1表达升高。
结论:
1.STON2通过改变MUC1启动子区DNA甲基化调控其表达。
2.DNMT1介导STON2调控MUC1启动子甲基化的过程。
前期研究已成功诱导和鉴定卵巢癌干细胞样细胞。在本研究中，利用LC-MS/MS无标记定量蛋白质组学和生物信息学分析，将Stonin2(STON2)鉴定为卵巢癌干细胞样细胞中差异表达蛋白。然而，目前对于STON2在癌症中的功能知之甚少，特别是与干性有关。依据先前STON2功能研究结果，推测卵巢癌干细胞样细胞STON2表达下调可能参与了其干细胞特征的维持。
在本研究中，首先对蛋白组学筛选的STON2表达下调进行验证，证实下调STON2表达能促进卵巢癌干细胞样细胞干性的维持，表现为CD44+CD24-细胞亚群比例，干性相关蛋白Nanog和C-myc表达和自我更新成球能力增强，EMT相关标志物E-cadherin降低，而N-cadherin与Fibronectin升高。反之亦然。在此基础上，通过RNA-Seq及信息学分析，筛选出差异基因MUC1，随后用RT-PCR和Western blot验证STON2的下调后，MUC1升高;再用shRNA和过表达分别调控MUC1表达，卵巢癌干细胞样细胞干性特征随之正向改变;共表达MUC1与STON2，自我更新成球能力再次增强。证明MUC1作为下游分子参与STON2调控卵巢癌干细胞样细胞的干性活性。再通过焦磷酸甲基化测序，发现siRNA下调STON2后，MUC1启动子甲基化和DNMT1表达降低，而MUC1的表达升高;MUC1表达随DNMT1降低而升高;从而证实STON2通过调控DNMT1改变MUC1启动子甲基化水平，进而调控MUC1的表达。本研究首次证明了STON2通过DNMT1-MUC1途径调节卵巢癌干细胞样细胞的干性活性，为研发靶向干细胞药物提供了实验证据。
第一部分STON2对卵巢癌干细胞样细胞干性特征的影响
目的:
通过观察经无血清培养的卵巢癌干细胞样细胞中STON2的表达变化，以及调控STON2检测CD44+CD24-细胞亚群比例，干性相关蛋白Nanog和C-myc，EMT相关标志物和自我更新成球能力的变化，确定STON2对卵巢癌干细胞样细胞干性特征的影响。
方法:
本研究首先以Western blot证实STON2在卵巢癌干细胞样细胞中表达差异;再用shRNA和过表达分别调控STON2表达后，观察卵巢癌干细胞样细胞干性特征的变化，以FCM检测CD44+CD24-细胞亚群比例，Western blot检测干性相关蛋白Nanog和C-myc，RT-PCR检测EMT相关标志物E-cadherin、N-cadherin和Fibronectin，自我更新成球能力，以及体外NOD/SCID鼠成瘤能力为观察指标。旨在阐明STON2对卵巢癌干细胞样细胞干性特征的调控作用。
结果:
1.RT-PCR、Western blot结果均证实STON2在卵巢癌干细胞样细胞中表达低于亲本细胞，差异具有显著性(p＜0.05)。
2.STON2低表达促进卵巢癌干细胞样细胞干性特征，表现为CD44+CD24-比例增高，干性相关蛋白Nanog和C-myc表达增加，自我更新成球能力增强。
3.STON2低表达促进上皮间质转化，表现为E-cadherin降低，而N-cadherin与Fibronectin升高。
4.STON2低表达促进体内成瘤。
5.STON2高表达抑制卵巢癌干细胞样细胞干性特征，表现为CD44+CD24-比例降低，干性相关蛋白Nanog和C-myc表达降低，自我更新成球能力减弱。
6.STON2高表达抑制上皮间质转化，表现为E-cadherin升高，而N-cadherin与Fibronectin降低。
结论:
1.STON2在卵巢癌干细胞样细胞中低表达。
2.下调STON2能促进卵巢癌干细胞样细胞干性特征及上皮间质化。
3.上调STON2能抑制卵巢癌干细胞样细胞干性特征及上皮间质化。
第二部分MUC1作为STON2的下游靶基因参与调节卵巢癌干细胞样细胞干性特征
目的:
通过RNA-seq和生物信息学分析方法，筛选并验证参与STON2调节卵巢癌干细胞样细胞干性特征的下游靶基因。
方法:
首先，收集shNC和shSton2肿瘤干细胞样细胞，提取总RNA，并在IlluminaHiseq平台上进行RNA-seq检测（每组设3次生物学重复）。测序得到的数据进行生物信息学分析，筛选差异表达基因，并进行KEGG和GO聚类分析。筛选出差异最明显的基因MUC1。随后采用RT-PCR和Western blot观察STON2的下调后，MUC1表达情况;再用shRNA和过表达分别调控MUC1表达后，观察卵巢癌干细胞样细胞干性特征的变化，以FCM检测CD44+CD24-细胞亚群比例，Western blot检测干性相关蛋白Nanog和C-myc为观察指标。同时过表达MUC1与STON2，观察MUC1对STON2过表达所导致的自我更新成球能力改变的影响。
结果:
1.RNA-seq测序共得到824个差异表达基因，其中包括299个下调基因，525个上调基因，其中MUC1上调最为显著。
2.GO及KEGG聚类分析发现分子功能主要体现在相互结合，酶抑制活性等。
3.RT-PCR和Western blot证实MUC1是STON2的下游靶基因，差异具有显著性(p＜0.05)。
4.MUC1低表达抑制卵巢癌干细胞样细胞干性特征，表现为CD44+CD24-比例以及干性相关蛋白Nanog和C-myc表达降低。
5.MUC1高表达促进卵巢癌干细胞样细胞干性特征，表现为CD44+CD24-比例以及干性相关蛋白Nanog和C-myc表达升高。
6.MUC1作为STON2的下游靶基因参与调节卵巢癌干细胞样细胞干性特征。
结论:
1.MUC1是STON2的下游靶基因。
2.MUC1正向调控卵巢癌干细胞样细胞干性特征。
3.MUC1作为STON2的下游靶基因参与调节卵巢癌干细胞样细胞干性特征。
第三部分STON2通过DNMT1调控MUC1启动子区DNA甲基化及其表达
目的:
研究STON2对MUC1的调控机制。
方法:
首先，用DNA甲基化抑制剂处理经siNC和siRNA-STON2转染的细胞，RT-PCR观察MUC1mRNA水平;其次用siRNA调控STON2表达后，焦磷酸测序分方法观察MUC1启动子富含CpG区的甲基化状态;用siRNA调控STON2表达后，Western blot检测DNMT1和MUC1的表达;最后用siRNA调控DNMT1表达后，RT-PCR和Western blot检测MUC1表达。
结果:
1.特异性siRNA下调STON2后，MUC1启动子区DNA甲基化和DNMT1表达降低，而MUC1表达升高。
2.特异性siRNA下调DNMT1后，MUC1表达升高。
结论:
1.STON2通过改变MUC1启动子区DNA甲基化调控其表达。
2.DNMT1介导STON2调控MUC1启动子甲基化的过程。