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背景:“解毒方”（Jiedufang,JDF）在治疗原发性肝癌方面取得了很好的临床疗效,但关于JDF调节中晚期原发性肝癌患者炎性因子方面的研究较少。部分患者由于胃肠道功能较差等原因,无法应用JDF治疗。JDF组成药物之一石见穿,为凌教授门诊最常用植物抗癌药物,迷迭香酸（Rosmarinic acid,RA）为石见穿中含量较高的多酚类化学成分,并且迷迭香酸具有良好的抗肿瘤效果,但针对肝癌炎性因子方面的研究欠缺。前期研究表明,JDF干预M2型巨噬细胞能明显减少趋化因子11（C-X-C Motif Chemokine Ligand 11,CXCL11）的表达,CXCL11对肿瘤的发生发展有重要影响,但其对肝癌的影响仍不完全清楚。因此,本课题主要探究JDF对中晚期原发性肝癌患者炎性因子的影响,以及RA抗肝癌的作用及具体机制,可以为JDF和RA治疗肝癌的临床应用上提供新的理论依据。目的:1.观察JDF对中晚期原发性肝癌患者炎性因子的影响。2.观察CXCL11对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用。3.通过体内外实验观察RA是否能抑制CXCL11诱导的肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的效应及作用机制。方法:1.回顾性分析2018年1月至2020年1月于长海医院中医肿瘤科住院,确诊为中晚期原发性肝癌的患者,分为JDF组与对照组。用m RECIST评价患者近期疗效,用Elisa法检测患者治疗前及治疗6个月后,血清中炎性因子IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、CRP、CXCL2、CXCL10、CXCL11、HGF、IGFBP2、MCSF、TGFβ1、VEGF的变化情况。2.通过CCK8实验、平板集落形成及Transwell小室迁移和侵袭实验,检测CXCL11（25,50,100ng/m L）对肝癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的作用,以及RA（25,50,100μmol/L）对此的拮抗作用。3.准备3组状态良好的贴壁Huh7细胞,对照组无处理,CXCL11+RA组加入RA（25μmol/L）,培养2h后,CXCL11+RA组和CXCL11组加入CXCL11（100ng/m L）。24h后将上述三个组的上清液分别收集到EP管中,用CSP100plus蛋白芯片检测各组蛋白表达量,以探究RA及CXCL11对肝癌影响的相关通路。4.通过Western Blot法,检测CXCL11对上皮-间充质转化（Epithelial Mesenchymal Transformation,EMT）相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail、Twist1的影响,以及基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达,验证其是否通过AKT、ERK、Smad2/3信号通路起作用。5.用LUC-LM3细胞构建裸鼠肝原位移植瘤模型及裸鼠远处转移瘤模型,随机分为对照组和RA组,行小动物活体成像观察肝脏肿瘤及肺部肿瘤大小,并对肝原位移植瘤模型裸鼠的肝脏肿瘤行免疫组化染色检测凋亡相关蛋白PTEN、BAX、BCL-2、CASPASE-3及EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail、Twist1、MMP 2、MMP 9的表达。对肺转移瘤模型裸鼠的肺部行免疫组化染色,检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail、Twist1、MMP2、MMP9的表达。进一步在体内探究RA抑制肝癌转移的效应机制。结果:1.本研究共纳入80例中晚期原发性肝癌患者,根据是否服用JDF,分为JDF组和对照组,各40例。两组患者治疗前及治疗至少6个月后,分别检测入院时肝肾功能（TBIL、ALT、AST、ALP、Cr）,及血常规（WBC、HB、PLT）情况。治疗前,JDF组与对照组肝肾功能和血常规差异无统计学意义。治疗6个月后,JDF组AST、ALP水平显著低于对照组（*P＜0.05）,但JDF组与对照组AST、ALP水平均在正常值范围内（29～35U/L、45～135U/L）,此差异没有临床意义。2.分析两组患者治疗至少6个月后最近一次入院的时的MRI情况,根据m RECIST标准,对两组患者的近期疗效进行评价,对照组客观缓解率ORR为25%,疾病控制率DCR为70%;JDF组客观缓解率ORR为47.5%,疾病控制率DCR为82.5%,JDF组客观缓解率显著高于对照组（*P＜0.05）。JDF组疾病控制率为82.5%,高于对照组的70%（差异无统计学意义）。3.治疗前对照组与JDF组患者炎性因子IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、CRP、CXCL2、CXCL10、CXCL11、HGF、IGFBP2、MCSF、TGFβ1、VEGF水平差异无统计学意义。治疗后JDF组患者血清中CRP、IL-8、TNF-α、CXCL11、IGFBP2水平显著低于对照组（*P均＜0.05）。JDF组治疗前相较于治疗后,HGF的水平显著下降（#P＜0.05）,对照组治疗前后HGF水平差异无统计学意义。4.CCK8实验结果显示,不同浓度的CXCL11（25,50,100ng/m L）处理Huh7细胞,均可促进细胞增殖。其中50ng/m L浓度CXCL11处理Huh7细胞48h促进增殖的效果显著（P＜0.05）。100ng/m L浓度CXCL11可呈时间依赖性的促进Huh7细胞增殖。不同浓度的RA（25,50,100μmol/L）处理肝癌Huh7细胞,作用24h时,100μmol/L浓度RA对细胞的抑制率最高,为43.34%。各浓度下RA处理肝癌Huh7细胞48h时,对细胞的抑制率分别19.82%、58.78%、72.45%。RA处理Huh7细胞72h,抑制作用非常明显,分别为43.36%、70.26%、86.68%。50μmol/L浓度的RA可拮抗100ng/m L CXCL11的促增殖作用。5.平板集落形成实验结果显示,50ng/m L的CXCL11作用Huh7细胞10天后,集落形成数量较空白对照组显著增多（*P＜0.05）。而加入50μmol/L浓度的RA可显著减少集落形成数量（#P＜0.05）。6.Transwell小室迁移侵袭实验结果显示,用不同浓度的CXCL11（25,50ng/m L）分别处理Huh7细胞、Bel-7402细胞和HCCLM3。浓度为50ng/m L时,与对照组相比,CXCL11可显著增加各细胞系迁移、侵袭细胞数（*P＜0.05）;浓度为25ng/m L时,与对照组相比,CXCL11可增加各细胞系迁移、侵袭细胞数,差异无统计学意义（P＞0.05）;同时加入50ng/m L CXCL11与25μmol/L RA,相较于只加入50ng/m L CXCL11,各个细胞系侵袭、迁移细胞数量显著减少（#P均＜0.05）。7.Western Blot实验结果显示,CXCL11可下调E-cadherin的表达,使N-cadherin,Vimentin、Snail、Twist1、MMP2、MMP9的表达上升,而加入RA可上调E-cadherin的表达,下调N-cadherin,Vimentin、Snail、Twist1、MMP2、MMP9的表达。8.人基因蛋白表达谱芯片显示,CXCL11对Huh7细胞中多种蛋白的磷酸化表达有影响,RA能拮抗部分蛋白被磷酸化。PATHWAY信号通路分析发现,磷酸发生改变的蛋白多集中在AKT/ERK/Smad2/3信号通路上。9.Western Blot实验结果显示CXCL11能促进AKT、ERK、Smad2/3的磷酸化,且作用时间为60 min时其效应最明显。而分别应用AKT、ERK或Smad2/3抑制剂,相应的AKT、ERK或Smad2/3磷酸化蛋白表达降低。并且,分别应用AKT、ERK或Smad2/3抑制剂,能够拮抗CXCL11诱导的HCCLM3细胞中EMT相关蛋白表达。10.裸鼠肝原位移植瘤模型结果显示,RA组肝脏肿瘤ROI值显著低于对照组（*P＜0.05）,并且高剂量组（RH）的肝脏肿瘤ROI值显著低于低剂量组（RL）（#P＜0.05）。RA组ROI值显著低于对照组。肿瘤组织免疫组化结果显示,RA组PTEN、BAX、CASPASE-3表达量较对照组升高,而BCL-2表达量较低。裸鼠远处移瘤模型结果显示,RA组肺转移瘤的ROI值显著低于对照组（*P＜0.05）,并且高剂量组（RH）的肺转移瘤ROI值显著低于低剂量组（RL）（#P＜0.05）。肝原位移植瘤模型裸鼠肝脏肿瘤与远处移瘤模型裸鼠肺部的免疫组化结果显示,应用RA可明显下调肿瘤组织N-cadherin,Vimentin、Snail、Twist1、MMP2、MMP9的表达,上调E-cadherin的表达。结论:1.JDF可调节中晚期原发性肝癌患者多种炎性因子水平。JDF的抗肝癌作用可能与其降低原发性肝癌患者体内CRP、IL-8、TNF-α、IGFBP2、CXCL11的水平相关。2.RA可拮抗CXCL11对肝癌增殖和转移的促进作用。3.RA能抑制CXCL11诱导AKT、ERK、Smad2/3信号通路,从而影响EMT相关蛋白的表达,抑制肿瘤的迁移侵袭。