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口服给药因其便利性以及良好的患者依从性,已成为蛋白类药物最热门的研究方向之一。近年来,纳米载体显示出了口服递送蛋白类药物的巨大潜力。要使药物被有效吸收进入血液循环,纳米载体需先后克服肠道表面的粘液扩散屏障以及肠上皮细胞吸收屏障。而克服这两个生物屏障所需纳米载体的表面性质是相互矛盾的。精准调控纳米载体呈现所需的表面性质,使其能够逐级穿越两种屏障达到高效的药物吸收,是利用纳米载体提高药物口服生物利用度的关键。本课题基于空肠上皮细胞表面的酸性微环境(pH介于5.3-6.0之间),拟通过智能生物响应原理精准调控纳米载体的表面性质,使其在粘液扩散和上皮细胞吸收所需性质之间转变,构建一种可逐级“动态”跨越粘液层和上皮细胞两种屏障的口服纳米给药系统。1、上皮细胞表面酸性微环境响应的纳米载体的制备及表征将具有优越粘液穿透性能的聚乙二醇2000(PEG2000)和高细胞亲和力的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)以pH敏感的腙键相连,合成了智能粘液穿透材料(PEG-Hyd-PLGA),并通过红外光谱及核磁共振氢谱对其进行了表征。以胰岛素为模型药物,采用复乳/溶剂挥发法制备包载胰岛素的具有核壳结构的PEG-Hyd-PLGA纳米粒。通过单因素考察筛选出最优工艺,所得纳米粒粒径为139.6±1.1 nm,PDI 为 0.169±0.021,Zeta 电位为-32.8±0.7 mV,包封率为 48.03±3.30%,载药量为4.65±0.30%。体外释放结果显示,纳米粒中胰岛素在PBS(pH6.8)缓冲液中呈现出先突释然后缓释的释药行为,12h内的累积释放率为43.06%。冻干保护剂筛选结果表明,以5%PEG4000作为纳米粒冷冻干燥过程中的冻干保护剂,样品复溶后的平均粒径、分布以及Zeta电位与冻干前最为接近。纳米粒中胰岛素的稳定性研究结果表明,纳米粒的制备过程和释放过程对其包载胰岛素的二级构象和生物活性均无影响。体外酸性环境响应能力的考察结果显示,在弱酸性环境中,PEG链能够逐渐从纳米粒表面脱落,暴露出连接在PLGA上的肼基,表面电位上升,表明其具有在酸性环境中,响应性脱落亲水性PEG外壳,暴露高细胞亲和力的PLGA内核的能力,显示出提高胰岛素口服吸收的巨大潜力。2、上皮细胞表面酸性微环境响应的纳米载体的口服吸收机制研究以荧光染料DiD标记纳米粒。粘蛋白吸附实验结果表明,在空肠液pH条件下(pH6.8左右),PEG-Hyd-PLGA结构中酸敏感的腙键能够保持稳定,此时由于外部PEG亲水层的保护,纳米粒与粘蛋白之间的亲和力显著减小,具有较强的粘液穿透能力。当孵育pH模拟空肠上皮细胞表面存在的酸性微环境(pH5.3-6.0)时,PEG-Hyd-PLGA纳米粒的酸敏感键断裂,暴露出疏水的PLGA内核,纳米粒表面疏水性大大增强,0.5h内与粘蛋白的聚集率增加了 10%。由此表明,当纳米粒到达上皮细胞表面酸性微环境时,其表面性质可以由粘液穿透逐渐转变为高细胞亲和力。以Caco-2细胞为模型,研究PEG-Hyd-PLGA纳米粒的细胞毒性及细胞摄取。结果显示,在pH7.4和6.0的条件下,不同浓度纳米载体(0.02-2mg/mL)的细胞存活率均高于90%,表明该载体材料无明显细胞毒性,较安全,适合作为纳米载体。细胞摄取实验结果显示,随着pH的降低,PEG-Hyd-PLGA纳米粒组的细胞摄取量增加,且当细胞表面存在粘蛋白时,其细胞摄取量显著高于PEG-PLGA纳米粒组和PLGA纳米粒组。表明PEG-Hyd-PLGA纳米粒能够很好地减少与粘蛋白的相互作用,并且在酸性环境下逐渐暴露出疏水性内核,增加细胞摄取量。大鼠空肠粘液穿透实验结果表明,PEG-Hy d-PLGA纳米粒具有很强的粘液扩散能力,能够到达深层粘液处。在体肠吸收实验结果表明,PEG-Hyd-PLGA纳米粒既能快速均匀地分布于肠绒毛的周围,不被粘液所阻隔,又能在空肠上皮细胞表面酸性微环境中逐渐断裂PEG链,较好地被上皮细胞吸收。体外酶降解实验结果表明,在模拟肠液(含胰酶)中,游离胰岛素极易被降解,而所制备的纳米粒可有效抵抗胰酶对其包载胰岛素的降解。综合以上实验结果,我们构建的PEG-Hyd-PLGA纳米粒可以保护胰岛素免被胰酶降解,并兼具穿透粘液层和被上皮细胞吸收的能力,具有口服治疗糖尿病的巨大优势。3、载胰岛素的PEG-Hyd-PLGA纳米粒在正常大鼠以及糖尿病大鼠体内的降血糖活性研究在正常大鼠体内,PEG-Hyd-PLGA纳米粒组(50IU/kg)表现出较强的降血糖作用,6 h时大鼠血糖水平降至最低,为初始值的58.59%,直至10 h大鼠血糖始终维持在60%的水平,其药理相对生物利用度为2.66%,分别是PEG-PLGA纳米粒组和PLGA纳米粒组的1.55倍和1.29倍。通过腹腔注射链脲佐菌素建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型,考察纳米粒对糖尿病模型大鼠的治疗效果。结果表明PEG-Hyd-PLGA纳米粒组(100 IU/kg)的降血糖作用最为显著,且该作用更为持久,能够将血糖降至初始值的60%左右,其相对药理生物利用度为4.81%,分别是PEG-PLGA纳米粒组和PLGA纳米粒组的2.41倍和1.62倍。综上所述,本课题构建的PEG-Hyd-PLGA纳米给药系统具有快速穿透粘液的能力,并且在空肠上皮细胞表面酸性微环境中响应性地断裂释放粘液穿透PEG的外壳,实现了纳米粒表面性质由亲水性向疏水性的转变,继而提高了其跨上皮细胞吸收的能力。该给药系统在蛋白类药物的口服给药中具有一定的潜在应用价值,为其他蛋白类药物的口服递送系统的设计提供了理论依据和实验基础。