在大多数脊椎动物和无脊椎动物中，多数兴奋性神经元是谷氨酸能神经元（glutamatergic neuron）。和其他神经递质系统不同，谷氨酸能神经元表达一种能够将谷氨酸转载到囊泡中的蛋白，统称为囊泡谷氨酸转运体(vesicular glutamatetransporters，VGLUTs)，从而利用广泛存在的谷氨酸作为神经递质。因此，VGLUTs是谷氨酸能神经元的重要标记物。在小鼠脊髓背角中的谷氨酸能神经元主要表达囊泡谷氨酸转运体2(VGLUT2)。目前关于VGLUT2表达的转录调控机制尚不清楚。本课题的研究目标是找出小鼠脊髓背角VGLUT2的顺式作用元件和结合在该元件上的转录因子，并探究下调VGLUT2表达的情况，是否导致谷氨酸能神经元转变成GABA能神经元。　　我们运用自下而上的方法(bottom-up approach)研究小鼠脊髓背角中VGLUT2表达的转录调控机制。首先，通过生物信息学和鸡胚电转(in ovoelectroporation)的方法，我们发现VGLUT2基因位点上两段紧密相连，长度约为1kb，进化上保守的非编码序列VCR34（VGLUT2 Conserve Region3&4）有顺式作用元件（cis-element）的活性。进一步，我们构建了VCR34-GFP转基因小鼠，发现GFP的表达情况可以模拟脊髓背角内源性VGLUT2的表达。　　为了验证VCR34是否是VGLUT2基因重要的顺式作用元件，我们构建并分析了VCR34neo/ne0和VC34-/-突变小鼠，发现VCR34对发育中脊髓背角和前脑等区域VGLUT2的正常表达发挥重要作用。　　在原代脊髓和前脑神经元中分析VCR34和它的截短突变片段驱动萤光素酶表达的活性（luciferase activity），我们鉴定出在VCR34中一段长度约为200 bp的核心序列，命名为VCR4-1(abcd);再通过DNA-protein pulldown实验和基于文献的分析，我们发现具有抑制或激活VCR4-1(abcd)驱动的萤光素酶表达的反式作用因子（trans-regulatory factors）。　　其中，具有激活能力的转录因子分别是隶属于第四类POU结构域家族蛋白的Bm3a(Pou4f1)和bHLH结构域家族蛋白的Ngn2。进一步通过萤光素酶活性检测实验，我们发现Brn3a和Ngn2激活VCR4-1(abcd)驱动的萤光素酶的活性位点。运用ChIP-realtime PCR的方法证明在脊髓中Brn3a可以结合VCR34核心序列，但Ngn2不能;在前脑中，Ngn2可以结合在VCR34核心序列上。运用电泳迁移率变动实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）发现Brn3a和Ngn2可以直接与其萤光素酶激活位点相结合。与以往的研究不同，我们发现的新结合位点与传统结合位点存在明显差异。以往的研究表明Ngn2需要和辅助蛋白E47形成异源二聚体才能结合在含有E-box的DNA序列上。在我们的研究中发现，Ngn2不需要辅助蛋白，即可结合在DNA片段上。　　最后，在原代脊髓和前脑神经元中特异性敲减Brn3a和/或Ngn2，我们发现Brn3a是维持脊髓神经元VGLUT2正常表达的必需因子，而Ngn2是维持端脑神经元VGLUT2正常表达的必需因子。　　上述结果表明，VCR34是脊髓背角和端脑神经元VGLUT2的顺式作用元件;Brn3a和Ngn2直接与VCR34结合来调控VGLUT2的表达，是其重要的反式作用元件。本研究不仅提供了特异性兴奋性神经元表达的专一元件，而且为深入探讨其他囊泡谷氨酸转运体表达的转录调控机制提供了新思路，并为深入了解谷氨酸能神经元的发育调控奠定良好基础。