当归多糖在体外抑制HCMV感染所致巨核系细胞凋亡中的应用探讨

来源 :中山大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sunshu
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
近年来随着免疫低下人群的增多,HCMV感染及其引发的严重疾病受到重视,其中对造血系统分化和增殖的抑制又是其中的热点,本课题组自1997年以来已完成了HCMV对粒一巨噬系祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(CFU-E)、多向造血祖细胞(CFU-Mix)、巨核系祖细胞(CFU-MK)及前髓系细胞影响的研究,证实了HCMV体外感染对它们均有抑制,并呈浓度依赖性,同时也证实了HCMV体外感染CHRF细胞、HL-60细胞可加重其凋亡,且呈剂量依赖性。随着研究的不断深入,相应地干预细胞凋亡的手段可望成为治疗此类凋亡相关性疾病的新策略,目前已有大量的临床实践表明,单独用中药或中西结合治疗此类疾病疗效确切。本试验就是在此基础上,用现代医学测试手段,从细胞学角度探讨当归多糖在体外治疗HCMV感染致人巨核系细胞凋亡中的作用,以便为临床用药治疗HCMV感染引起的血小板减少性疾病提供理论指导和依据,也为开发中药,发扬祖国的传统医学提供新的思路。 材料和方法: 1.材料 HCMV AD169株由中国武汉病毒研究所提供,效价为10<-5>TCID<,50>/ml。病毒原液分装冻存管,-80℃低温冰箱储存。CHRF-288-11细胞株、当归多糖(APS)由香港中文大学儿科系实验室提供。 2.方法 CHRF-288-11细胞株用含10﹪FBS、100单位/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素的RPMI1640培养基培养,在37℃、5﹪CO2条件下培养,每周换液2次,传代1次。取对数增殖期细胞做实验。 HCMV原液直接感染A组CHRF细胞株,使其终浓度为10<-2>原液,于病毒感染后第3天加入不同浓度的当归多糖(APS),根据加入HCMV及APS浓度的不同,实验分为五组,并设对照组。 A1大剂量APS组(CMV+LAPS) APS终浓度为200 μ g/ml. A2中剂量APS组(CMV+MAPS) APS终浓度为100 μ g/ml. A3小剂量APS组(CMv+SAPS) APS终浓度为50 μ g/ml. A4对照组未加入APSB 空白组未加入HCMV 未加入APS然后于不同时间收集各组细胞,分别进行凋亡检测。 (1)PCR扩增在病毒感染A组后第3天收集各组细胞,抽提DNA,做PCR扩增检测HCMV IEA,电泳后观察是否有特异性阳性条带,以鉴定HCMV是否直接感染CHRF细胞株。并分别向各组加入不同浓度当归多糖。 (2)Hoechst染色对不同时间的各组细胞进行染色,即刻在荧光显微镜下观察细胞形态。细胞内核DNA出现不同程度固缩、碎裂的细胞即为凋亡细胞。 (3)MTT法收集不同时间的各组细胞,加入MTT显色后,在酶标仪检测光密度值,计算细胞存活率。 (4)DNA ladder收集不同时间的各组细胞,常规抽提DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳,观察是否有特征性凋亡梯形条带。 (5)AImexin V/PI双染流式细胞仪分析收集不同时间的各组细胞,每组至少10<6>个细胞,PBS清洗、离心,加入Annexin V/FITC和碘化丙锭溶液,混匀后避光染色;同时以不加Amlexin V/FITC及PI的为对照,用400目丝网过滤后,即刻用流式细胞仪分析检测凋亡细胞。 结果: 1.PCR扩增后,在2﹪的琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下可见HCMV IEA特异性扩增条带。 2.在HCMV感染CHRF细胞后第3、5、7天,通过Hoechst染色在各组可观察到不同程度的凋亡细胞,而在其对照组凋亡细胞则相对较多。 3.在A组中,于HCMV感染的第3天加入APS后,对不同时间的细胞进行MTT法检测,记录细胞存活率(﹪)。第5天,CMV+LAPS组86.46±5.11, CMV+MAPS组76.57 ±5.78,CMV+SAPS组66.17±4.24,对照组55.94±5.05,空白组117.50±4.31;第7天,CMV+LAPS组76.66±3.13,CMV+MAPS组65.57±7.22,CMV+SAPS组54.48 ±4.27,对照组43.40±6.94,空白组131.83±7.22。结果显示在HCMV感染的A组细胞中,随着加入当归多糖剂量的增加,细胞存活率有上升的趋势。 4.在病毒感染后第5天,收集各组细胞抽提DNA,经电泳可见各组的特征性梯形条带,在HCMV感染的A组中随着加入当归多糖剂量的减少,条带逐渐清晰。 5.在A组中,于HCMV感染的第3天加入APS后,Annexin V/PI染色观察凋亡细胞,记录凋亡率(﹪)。第5天,CMV+LAPS组26.10±1.99,CMV+MAPS组30.11±1.85, CMV+SAPS组34.79±1.79,对照组37.84±0.97,空白组10.34±0.84;第7天, CMV+LAPS组38.70±1.37,CMV+MAPS组43.22±1.51,CMV+SAPS组47.71±2.78,对照组52.20±3.38,空白组19.42±2.88。从结果可观察到,在HCMV感染的A组中随着加入当归多糖剂量的减少,凋亡率呈上升趋势。 结论: 1、HCMV ADl69株在体外可直接感染巨核系细胞并降低其存活率。 2、HCMV ADl69株在体外感染巨核系细胞后可诱导其加重凋亡,其凋亡率与时间呈正相关。 3、在HCMV ADl69株体外感染巨核系细胞后,向培养细胞中加入当归多糖,可以提高受染细胞的存活率,表明当归多糖对}tCMV感染的巨核系细胞有一定的保护作用。 4、当归多糖在一定程度上能抑制HCMV体外感染诱导的巨核系细胞凋亡,且呈剂量依赖性。
其他文献
《科学学与科学技术管理》杂志2001年第2期刊登了广东职业技术师范学院李田先生的文章《科学性和规范性是大学评价的根本要求--对〈中国大学评价〉的几点质疑》(以下简称《规
摘要:随着社会的发展,小学科学教学越来越受重视,教师为了让小学生主动参与到科学学习中来,经常将课堂趣味实验引入到教学活动中去,让课堂充满趣味性,由此可见课堂趣味教学在小学科学教育中的重要性。因此,本文将围绕小学科学课堂趣味实验开展的意义进行简单的论述,同时,深入探究一下将课堂趣味实验运用到教学中的有效策略。  关键词:小学科学;趣味实验;开展;意义;策略  一、 前言  伴随着社会的不断发展,在小
摘要:“学起于思,思源于疑”。质疑是学生学习的一个重要能力,是开启创新之门的钥匙。在课堂中引导学生学会质疑,是课堂教学的最高境界。本文主要以五年级下册的一篇课文《桥》为例,从三个方面浅谈如何在小学语文课堂教学中架起学生质疑的桥梁:创设质疑情境,教给质疑方法,养成质疑习惯。  关键词:质疑;方法;习惯  《义务教育语文课程标准(2011)》中明确指出:“学生是学习的主体,语文课程必须根据学生身心发展
机顶盒市场概览 机顶盒市场正经历着前所未有的快速增长,预计在2002年以前每年的需求量都将以百万台的数量级增长。 目前机顶盒市场依据网络类型来分有三大应用市场:卫星电视、有线
如何将“让儿童追赶课程”变成“让课程追随儿童”,真正确立“儿童中心说”的课改理念呢?学校经历了16年的探索,打造了“城小之最”特色课程,蹒跚地走出了一条具有本土化特色
摘要:新课改将语文课程的价值基础定位于中华文化,要求通过诵读国学经典,提升学生的人文素养。国学经典继承与提取了人类文化的精髓,学生通过诵读,可增添自身生命的底色,在学习优秀文化知识的同时,实现健康成长。本文阐述了小学生诵读国学经典的重要意义,分析了小学语文教学中国学经典的特点,并提出了具体的教学路径,希望能够有效提升小学生的人文素养。  关键词:诵读;国学经典;小学生;人文素养  素质教育强调小学
摘要:随着当前社会经济及科学技术的飞速发展,教育事业得到了较大程度的发展,教学理念更加重视以学生为课堂主体,同时尊重学生个性差异化。课堂教学过程中,通常要结合学生个性特点开展个性化教育。信息技术教学的过程中,对于教师而言,  应避免采用一刀切教学模式,要结合学生的实际情况采用针对性的教学方案,关注学生的差异性,进而提高学生学科素养。本文主要对差异化教学模式在信息技术教学中的应用进行研究,以供相关专
摘 要:本文围绕语文学科的核心素养,探究了关于提升文学类文本之小说阅读能力的方法,认为情境式阅读是切实可行的。  本文从小说阅读教学的现状分析出发,得出了情境式阅读方法的重要性,再结合核心素养的具体要求,分别从语言、结构和文化三个角度具体阐述情境式阅读的方法。文中例举了近两年高考试题,结合范例,在方法上具有可操作性及较强的指导意义。  关键词:核心素养;小说阅读;情境式  《普通高中语文课程标准(
Schwannomas are mesenchymal tumors originating from Schwann cells in peripheral nerve sheaths. Although the tumor can be located in any part of the human body,
几年来各地区在信息的采编中,写出了许许多多富于形象艺术、生动活泼的信息,创造了不少新鲜的词汇。如:“政府及有关部门说话要算数,一不患‘红眼病’,二不要‘卡脖子”’(